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Recombination and packaging of flaviviruses
Christian Taucher
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Christian Mandl
DOI
10.25365/thesis.5897
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29721.15789.371855-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Genus Flavivirus umfasst eine Reihe wichtiger menschlicher Krankheitserreger. So sind zum Beispiel das Dengue, West Nile oder Japanische Enzephalitis Virus als wiederaufkommende Erreger klassifiziert worden und dringen in neue Gebiete vor. Das Ziel dieser Doktorarbeit war, zwei wichtigen Aspekten der Biologie von Flaviviren auf den Grund zu gehen: einerseits die Rekombination von Flaviviren und andererseits die Verpackung des viralen RNA Genoms. Hierfür wurde ein neuer, innovativer Ansatz entwickelt. Das Grundprinzip beinhaltet zwei defekte Viren, so genannte Replikons, denen jeweils unterschiedliche Viruspartikelbausteine fehlen wodurch sie keine infektiösen Viruspartikel mehr bilden können. Beide Replikons besitzen jedoch die Fähigkeit in einer Wirtszelle das virale Genom zu vervielfältigen und in Proteine zu übersetzen. Wenn beide Viren in der gleichen Zelle vorhanden sind, kodieren sie für alle Proteine, die für ein Viruspartikel nötig sind. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass beide Replikons in infektiöse Partikel verpackt werden. Allerdings ist das System nicht so effizient wie ein einzelnes Genom auf dem alle Virusbausteine kodiert sind. Aus diesem Grund können „Ganzlängengenome“, die durch Rekombination der beiden defekten Genome entstehen können, in Zellpassagen gesucht werden. Dieses System wurde auf die drei Flaviviren Frühsommermeningoenzephalitis Virus (FSME), WNV und JEV angewandt.
Interessanterweise, wurde in keinem Fall exakte homolge Rekombination zu Wildtype Virus beobachtet, obwohl dies als sehr wahrscheinlich galt. Allerdings konnte Rekombination zu infektiösen Ganzlängen Viren in einem der drei Virussystemen gezeigt werden. Beim JE Virus führte ungenaue homologe Rekombination zu Viren mit ungewöhnlicher Genomstruktur und im Vergleich zum Wildtype Virus reduzierten Wachstum.
Obwohl keine intermolekulare Rekombination zu infektiösen Viren beim FSME Virus gefunden werden konnte, entwickelten sich die defekten FSME Viren durch den Verlust von Sequenzen, herbeigeführt wahrscheinlich durch einen intramolekularen Rekombinationsprozess. Den enstandenen Mutanten fehlte ein Teil eines Nichtstrukturproteins wodurch sie nicht mehr in der Lage waren ihr RNA Genom zu vervielfältigen. Allerdings konnte dieser Defekt in Anwesenheit eines Replikons (oder eines infektiösen Virus) kompensiert werden. Die Mutanten erlangten dann wieder die Fähigkeit ihr Genom zu vervielfältigen und stellten damit im eigentlichen Sinn defekte hemmende RNA Moleküle dar.
Die Tatsache, dass diese Mutanten in Viruspartikel verpackt werden konnten, zeigte, dass die ihnen fehlenden Sequenzen nicht für die Verpackung wichtig waren. Um die Anforderungen an das Kapsidprotein für die Verpackung genauer zu analysieren, wurde das Kapsidprotein des WNV genauer untersucht. Die Wegnahme von kurzen Sequenzen in einer konservierten, hydrophoben Region wurde vom Virus zwar toleriert. In zwei Fällen traten jedoch Revertanten auf, denen mehr als ein Drittel der Sequenz für das WNV Kapsidprotein fehlten. Eine genauere Analyse zeigte, dass diese reduzierten Kapside ausreichten um das virale Genom zu verpacken.
Zusammenfassend zeigt diese Dissertation, dass Flaviviren eine sehr geringe Tendenz zu homologer Rekombination aufweisen. Zugleich beschreibt sie das erste Rekombinationssystem im Labor, das ein ungenaues Rekombinationsereignis zwischen Flavivirus Genomen zeigen konnte. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Flaviviren eher zu intramolekularer Rekombination neigen, was zum Verlust von Sequenzen führt. Die spontan enstandenene defekten hemmenden RNA Moleküle sowie die funktionstüchtigen WNV Kapsid Mutanten lieferten Informationen über die Verpackung des viralen Genoms.
Abstract
(Englisch)
The flaviviruses include several important human pathogens of global medical importance. Diseases caused by the dengue viruses, West Nile virus (WNV) and Japanese encephalitis virus (JEV) have been classified as emerging diseases and are continuing to spread into new territory. The overall objective of this thesis was to address two fundamental issues that underlie the biology of flaviviruses: recombination among flavivirus genomes and packaging of the viral genome. To this end, an innovative trans-complementation system was established in this thesis. This system consists of two genomes each lacking a different part of the viral structural protein genes. Thus, neither of these so-called replicons is able to produce infectious virions by itself. When introduced together into the same host cell, however, they are able to complement each other and both replicons can be packaged into virion particles. Thus, these two replicons can be repeatedly passaged together providing ample opportunity for recombination events potentially generating full-length, infectious genomes. This system was applied to three different flaviviruses, i.e. tick-borne encephalitis virus (TBEV), WNV, and JEV
Surprisingly, in no case the recombination trap produced wild-type genomes by exact, homolgous cross-over events different from the general assumption that this would be the most likely event to occur. Intermolecular recombination yielding infectious full-length viruses was observed for one of the three viral systems, namely JEV. However, rather than generating wild-type genomes, aberrant homologous recombination resulted in recombinant JE viruses with unnatural gene arrangements and reduced growth properties compared to wild-type virus. In spite of the absence of any inter-molecular recombination events, the TBEV recombination trap evolved defective genomes with larger deletions presumably by a intra-molecular recombination process. The resulting mutants lacked part of a nonstructural protein gene and were thus by themselves incompetent for RNA replication. However, in the presence of the other replicon (or an infectious virus) these defects could be complemented in trans leading to successful replication of these mutants which thus represent proper sense ‘defective interfering particles’.
The fact that all of these deletion mutants could be packaged into virions demonstrated that these sequences were not essential for the packaging process. To analyze the requirements for packaging within the capsid protein in more detail, the WNV capsid protein was subjected to a specific deletion analysis. Artificially introduced deletions into a conserved hydrophobic region were mostly well tolerated. Spontaneously emerging pseudorevertants surprisingly included two mutants with significantly extended deletions removing more than a third of the entire capsid protein. Further analysis confirmed that those minimal capsids allowed packaging of the viral genome.
In summary, this thesis demonstrates that flavivirus genomes have a very low propensity, if any, for homologous recombination and provides the first laboratory recombination system yielding an aberrant homologous recombination event between flavivirus genomes. Furthermore, the data indicate that flavivirus genomes can readily undergo intramolecular recombination events leading to extended deletion mutations. The spontaneously formed defective interfering particles as well as viable capsid deletion mutants provided information on requirements for packaging of the viral genome.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
recombination packaging flavivirus virus
Schlagwörter
(Deutsch)
Rekombination Verpackung Flaviviren
Autor*innen
Christian Taucher
Haupttitel (Englisch)
Recombination and packaging of flaviviruses
Paralleltitel (Deutsch)
Rekombination und Verpackung von Flaviviren
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
130 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Herbert Nowotny ,
Paul Becher
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
44 Medizin > 44.75 Infektionskrankheiten, parasitäre Krankheiten
AC Nummer
AC07451704
Utheses ID
5292
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |