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Functional elucidation of auxin signalling manipulating effectors of Ustilago maydis

Julia Freund

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Biologie

Betreuer*in

Armin Djamei

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DOI

10.25365/thesis.71173

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-13560.42709.644870-5

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Pflanzen und Krankheitserregern ist ein sehr wichtiges Gebiet der Pflanzenforschung und ein grundlegendes Verständnis ihrer Mechanismen und Prinzipien ist von ökologischer und wirtschaftlicher Bedeutung. In dieser Arbeit liegt der Fokus auf dem Pilzmodellorganismus U. maydis, der ein biotropher Erreger der Kulturpflanze Z. mays ist, und darauf, wie der Pilz den Wirt durch Manipulation hormonell regulierter Stoffwechselwege wie Indol-3-essigsäure (Auxin) Signalisierung, die komplexe Pflanzenwachstums- und Entwicklungsprozesse auslöst, besiedelt. Ein zuvor von Janos Bindics durchgeführtes Screening der Effektorproteinbibliothek identifizierte zwei Effektoren, die die Pflanzenabwehr durch Induzieren des Auxin-Signalwegs stören. Ziel dieser Studie war es, den Wirkungsmechanismus zu untersuchen und die molekulare Funktion der Effektoren Inducer of Auxin Signalling (IAS1 & IAS2) zu charakterisieren. Daher wurden die Effektoren vorübergehend ohne Signalpeptid und mit Epitopmarkierungen im heterologen System N. benthamiana exprimiert. Das DR5-Reportersystem wurde als Indikator für die Auxin-Signalantwort verwendet, und die Experimente konnten die induzierende Wirkung beider Effektoren bestätigen. Zusätzlich lieferte ein mit einem DR5-Induktionstest verbundener subzellulärer Lokalisierungstest wesentliche Informationen über den Wirkort innerhalb der Zelle. Die experimentellen Daten zeigten, dass C-terminal fusionierte Tags die Proteine stabilisierten und dass IAS1 am meisten mit einem kleinen Tag induzierte, während IAS2 die höchsten Ergebnisse zeigte, wenn es mit großen Tags exprimiert wurde. Die ektopisch exprimierten Effektoren, die mit verschiedenen Fehllokalisierungsmarkierungen fusioniert waren, wurden durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. IAS1 zeigte ein starkes Signal im Nucleolus, eine sehr ausgeprägte Lokalisation (aber eine schwache im Zytosol) und IAS2 erschien im Zytosol und im Nucleus. In beiden Fällen gehe ich aufgrund der doppelten Lokalisierung und der schwächeren Induktion, wenn diese mit einem Lokalisierungs-Tag fusioniert wurden, von einer Doppelfunktion aus. Um primäre und sekundäre Effekte in den pflanzlichen Signalkaskaden zu trennen, wurde die Identifizierung potenzieller Effektor-Interaktionspartner (PEIPs) mittels Co-Immunopräzipitation des Effektors und anschließender Massenspektrometrie durchgeführt. Schließlich konnten durch Untersuchung der Veränderungen der Ergebnisse des DR5-Induktionstests in Planta, in denen PEIPs zuerst gesilenct wurden, Schlussfolgerungen über ihre molekulare Verbindung bei der Auxinsignalübertragung gezogen werden. Aufgrund von Kontaminationen im Reportersystem konnte jedoch keine gültige Auswertung vorgenommen werden. Bemerkenswert sind die beobachteten Phänotypen, die die gesilencten Pflanzen zeigten. Zu den physischen Veränderungen gehörten verkrüppelte und gebleichte Blätter sowie zwerggroße Pflanzen.

Abstract

(Englisch)

The study of plant-pathogen interaction is a very crucial area of plant research and a fundamental understanding of its mechanisms and principles is of ecological and economical importance. In this thesis the focus is on the fungal model organism U. maydis, which is a biotrophic pathogen to the crop plant Z. mays and on how the fungus colonizes the host by manipulating hormonal regulated pathways such as indole 3-acetic acid (auxin) signalling, which triggers complex plant growth and developmental processes. An effector candidate library-wide screen performed by Janos Bindics and Fernando Navarrete identified beforehand two effectors which interfere with the plant defence by inducing the auxin signalling pathway. The purpose of this study was to explore the underlying mechanisms and to characterize the molecular function of the effectors Inducer of Auxin Signalling (IAS1 & IAS2). Therefore, the effectors were transiently expressed without signal peptide and with epitope tags in the heterologous system N. benthamiana. The DR5 reporter system was applied as an indicator for auxin signalling response and the experiments could confirm the inducing effect of both effectors. Additionally, a subcellular localization assays linked to a DR5 induction assay provided essential information about the place of action within the cell. The experimental data revealed that C-terminal fused tags stabilized the proteins and that IAS1 induced the most with a small tag whereas IAS2 showed the highest results when expressed with large tags. The ectopically expressed effectors fused to various mislocalization tags were visualized via confocal microscopy. IAS1 showed a strong signal in the nucleolus, a very prominent localization, (but a weak in the cytosol) and IAS2 appeared in the cytosol and the nucleus. In both cases I hypothesize a dual function due to the dual localization and weaker induction whenever fused to a localization tag. In order to separate primary and secondary effects in the plant signalling cascades, the identification of potential effector-interaction partners (PEIPs) via co-immunoprecipitation of the effector followed by mass spectrometry has been applied. Finally, by examining alterations in the outcome of the DR5 induction assay in planta where PEIPs were silenced first, conclusions about their molecular connection in auxin signalling could be drawn. However, due to contaminations in the reporter system no valid evaluation could be made. Noteworthy are the observed phenotypes that the silenced plants displayed. Among the physical alterations were crippled and bleached leaves as well as dwarf-sized plants.

Autor*innen

Julia Freund

Haupttitel (Englisch)

Functional elucidation of auxin signalling manipulating effectors of Ustilago maydis

Paralleltitel (Deutsch)

Funktionelle Aufklärung von Auxin-Signalmanipulationseffektoren von Ustilago maydis

Publikationsjahr

2019

Umfangsangabe

xiv, 97 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Armin Djamei

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC15538935

Utheses ID

53309

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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