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Expression, purification and immunological characterisation of recombinant allergens from Blomia tropicalis and Dermatophagoides pteronyssinus in Escherichia coli

Eszter Sarzsinszky

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie

Betreuer*in

Rudolf Valenta

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DOI

10.25365/thesis.60419

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-25111.35828.452073-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Meine Masterarbeit an der Medizinischen Universität Wien widmete sich der Expression und Reinigung von rekombinanten Allergenen für die Entwicklung eines Allergen-Microarrays, welcher auch klinisch relevante Allergenmoleküle enthält, die in vielen Gebieten außerhalb Europas weit verbreitet sind. Nach gründlicher Literaturrecherche wurden drei Allergene aus Blomia tropicalis, einer Speichermilbe, die in den Tropen und Subtropen eine wichtige Allergenquelle darstellt, für die Expression und Reinigung ausgewählt. Die drei Blomia-Allergene (Blo t 5, Blo t 12 und Blo t 21) wurden nach klinischer Relevanz, IgE-Erkennungshäufigkeit, verwendetem Expressionssystem und Proteinertrag ausgewählt. Basierend auf den Daten aus der Expression und Charakterisierung eines vierten Allergens, Der p 20 aus Dermatophagoides pteronyssinus, wurde ein Manuskript erstellt und zur Publikation in einem wissenschaftlichen Journal eingereicht (Kapitel 5 und 6). Der p 20 ist eine Argininkinase (AK), welche mög-licherweise kreuzreaktiv mit homologen Proteinen aus anderen Allergenquellen ist. Dieses Allergen wurde jedoch bisher noch nicht im Detail charakterisiert. cDNA-Sequenzen von Blo t 5, 12, 21 und Der p 20 wurden von der Uniprot-Datenbank bezo-gen und als synthetische Gene mit einer zusätzlichen Sequenz, welche einen C-terminalen Hexahistidin-tag codiert, in pET-17b Vektoren für die Expression in E. coli bestellt. Der C-ter-minale Hexahistidin-tag ermöglicht die Reinigung der rekombinanten Allergene mittels Ni-ckel-Agarose. Expressionsmenge und Lokalisation der Zielproteine innerhalb der Expressions-zellen wurden mittels SDS-PAGE bestimmt. Die Proteine wurden entweder unter denaturie-renden oder gegebenenfalls unter nativen Bedingungen durch Affinitätschromatographie mit Nickel-Agarose gereinigt. Für die Reinigung aus E. coli Einschlusskörpern wurden Proteine durch Zugabe von Harnstoff gelöst und durch schrittweise Dialyse und gegebenenfalls Verwendung von Glutathion, um Oligomerisierung zu vermindern, wieder gefaltet. Gereinigte Allergene wurden mittels CD-Spektroskopie und Größenausschlusschromatographie analysiert, um Sekundärstrukturen und mögliche Aggregation zu bestimmen. Der p 20 und Blo t 21 wurden als lösliche Proteine gereinigt, während Blo t 5 und 12 sich in Einschlusskörpern ansammelten. CD-Spektren zeigten eine korrekte Faltung aller Proteine mit Ausnahme von Blo t 12, das einen erhöhten Prozentsatz an Zufallsstrukturen zeigte. Um die Bildung von Oligomeren aufgrund einer erheblichen Anzahl von Cysteinen zu verhindern (n=6), wurde die Reinigung und Rückfaltung von Blo t 12 nach Zugabe von Glutathion durchgeführt. Die Größenausschlusschromatographie zeigte, dass dieser Schritt die Bildung von Oligomeren tatsächlich reduzierte. Ein thermischer Denaturierungstest ergab jedoch, dass das rekombinante Protein nicht gefaltet war. Die IgE-Erkennungsfrequenz des rekombinanten Der p 20 wurde durch ELISA mit Seren von 98 Patienten mit allergischer Rhinokonjunktivitis und mildem Asthma, bedingt durch Haus-staubmilbenallergie, bestimmt. Die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass Seren von 27 der 98 allergischen Patienten allergenspezifisches IgE gegen rekombinantes Der p 20 enthielten. Patien-ten mit IgE-Reaktivität gegen Der p 20 berichteten zusätzlich häufiger über Atembeschwerden im Vergleich zu Der p 20 negativen Patienten. Das deutet darauf hin, dass Der p 20 ein Bio-marker für schwerere Formen von Haustaubmilben-Allergien sein könnte. Darüber hinaus wurde die Kreuzreaktivität zwischen Der p 20 und AKs anderer Organismen durch Western Blot untersucht. Ein Inhibitionstest zeigte, dass rDer p 20 die IgE-Bindung an AK in Extrakten aus Garnelen (L. vannamei) hemmte. Der p 20 könnte somit helfen, Kreuzre-aktivitäten zwischen Garnelen und HDM in Tropomyosin-negativen Patienten aufzuklären. Die gereinigten Milbenallergene (Blo t 5, 12, 21 und Der p 20) werden verwendet, um das Spektrum der Allergenmoleküle für die Diagnose von Milbenallergien zu erweitern und die Bedeutung der Blomia-Allergene für die Allergiediagnostik und die allergenspezifische Immuntherapie zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten die Bedeutung von Der p 20 als po-tenzieller Asthmabiomarker und kreuzreaktives Allergen. Weitere Studien werden erforderlich sein, um die allergene Aktivität von Der p 20, seine spezifische Rolle im Rahmen von Atem-wegsallergien als mögliche Ursache für schwere Symptome sowie seine Verwendung zur Unterscheidung zwischen Symptomen, die durch Tropomyosin oder AK verursacht werden, zu untersuchen.

Abstract

(Englisch)

The first part of my work at the Medical University of Vienna was dedicated to the expression and purification of recombinant allergen molecules for the generation of a novel customised allergen microarray that also covers clinically relevant allergen molecules which are prevalent in areas outside Europe. After thorough literature search, three allergens from Blomia tropicalis, a storage mite that is an important allergen source in the tropics and subtropics, were selected for expression and purification. The three Blomia allergens (Blo t 5, Blo t 12 and Blo t 21) were selected according to clinical relevance, IgE-recognition frequencies, used expres-sion system and protein yield. A fourth allergen, i.e., Der p 20 from Dermatophagoides pteronyssinus was the main topic of the manuscript in Chapters 5 and 6. Der p 20 is an arginine kinase (AK) and possibly cross-reactive with homologous proteins from other allergen sources that has not yet been characterised in detail. cDNA sequences of Blo t 5, 12, 21 and of Der p 20 were obtained from Uniprot-database and ordered as synthetic genes in pET-17b expression vectors including a sequence encoding a C-terminal hexahistidine-tag to facilitate purification of the recombinant allergens. Expression-levels and localisation of the target proteins within the host cells were determined by SDS-PAGE. Proteins were purified either under denaturing or, if appropriate, under native condi-tions by affinity chromatography using nickel-agarose. For purification from inclusion bodies, proteins were solubilised by urea and refolded by stepwise dialysis, eventually after addition of glutathione to avoid oligomerisation. Purified allergens were analysed by CD-spectroscopy and size-exclusion chromatography to determine secondary structures and possible aggregation. Der p 20 and Blo t 21 were purified as soluble proteins, while Blo t 5 and 12 accumulated in inclusion bodies. CD-spectra revealed proper folding of all proteins except Blo t 12 which showed a high percentage of random structures. To prevent formation of oligomers due to a considerable number of cysteines (n=6), purification and refolding of Blo t 12 were performed after addition of glutathione. Size-exclusion chromatography indicated that the presence of glutathione during purification actually reduced formation of oligomers, however, a thermal denaturation assay revealed that the recombinant protein was not folded. IgE-recognition frequency of recombinant Der p 20 was determined by ELISA in sera from 98 patients suffering from HDM-induced allergic rhinoconjunctivitis and mild asthma. ELISA results showed that sera of twenty-seven HDM allergic patients contained allergen-specific IgE against recombinant Der p 20. Patients with IgE reactivity to Der p 20 more frequently reported breathing-problems compared to Der p 20 negative patients, indicating that Der p 20 might be a biomarker for more severe forms of HDM allergy. In addition, cross-reactivity between AKs from different organisms was studied by Western blot. An inhibition assay showed that rDer p 20 inhibited IgE-binding to AK in extracts from shrimp (L. vannamei), suggesting that Der p 20 might help resolve cases of cross-reactivity between shrimp and HDM that are negative to tropomyosin. The purified mite allergens will be used to expand the spectrum of allergen molecules for the diagnosis of mite allergy and to study the importance of the Blomia allergens for allergy diagnosis and allergen-specific immunotherapy. Our results demonstrated the importance of Der p 20 as potential asthma biomarker and cross-reactive allergen. Further studies will be needed investigating the allergenic activity of Der p 20, its specific role in food and respiratory allergies as a potential cause of severe symptoms, as well as its use for the distinction between symptoms caused by tropomyosin or AK.

Autor*innen

Eszter Sarzsinszky

Haupttitel (Englisch)

Expression, purification and immunological characterisation of recombinant allergens from Blomia tropicalis and Dermatophagoides pteronyssinus in Escherichia coli

Paralleltitel (Deutsch)

Expression, Purifikation und immunologische Charakterisierung von rekombinanten Allergenen aus Blomia tropicalis und Dermatophagoides pteronyssinus in Escherichia coli

Publikationsjahr

2019

Umfangsangabe

vi, 79 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Rudolf Valenta

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC15560599

Utheses ID

53389

Studienkennzahl

UA | 066 | 830 | |

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