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Use of Flow Cytometry and Confocal Microscopy to Investigate the Infection of Arthrospira fusiformis by Cyanophages

Maryamalsadat Zekri

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Ecology and Ecosystems

Betreuer*in

Ingeborg Lang

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DOI

10.25365/thesis.60427

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-25097.12578.225654-1

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Arthrospira fusiformis ist ein Cyanobakterium, das unter extremen Bedingungen in Sodaseen vorkommt. Charakteristisch für Sodaseen sind hohe Temperatur, hoher pH-Wert und hohe Trübung. A. fusiformis ist die Haupt nahrungsquelle für viele Arten, wie zum Beispiel dem Zwergen Flamingo (Phoeniconaias minor). Daher wird in diesen System A. fusiformis als Motor für verschiedene ökologische Zyklen angesehen Schwankungen dieser Art wirken sich auf Flamingogemeinschaften und andere Nahrungsnetze aus. Der hohe Proteingehalt und die Ungiftigkeit von A. fusiformis machen es außerdem zu einem geeigneten Kandidaten für die Aquakultur, um beispielsweise Garnelen zu füttern Auch als Nahrungsergänzungsmittel findet sich A. fusiformis in der industriellen Verwertung wieder. Cyanophagen sind Viren, die Cyanobakterien infizieren und daher deren Population stark beeinflussen können. Vor allem der Übergang vom lysogenen zum lytischen Zyklus (Cyanophageninduktion) ist eine mögliche Ursache für den plötzlichen Kollaps von A. fusiformis. Wir untersuchten, ob sich Vireninfektionen an Arthrospira mittels konfokaler Laserscanning Mikroskopie nachweisen lassen. In dieser Studie wurde die Cyanophageninduktion mittels Durchflusszytometrie getestet. Wir untersuchten Proben aus den Seen Nakuru und Oloidien, beide in Kenia gelegen, und eine stamm Deborah (Name der Spenderin). Wir verwendeten 1,5 mg ml-1 Mitomycin (MMC) bei Deborah-Proben, um Prophagen zu induzieren. Nakuru und Oloidien-Proben wurden mit 24-stunden Licht und 24- stunden Dunkelheit behandelt. Die Proben wurden durch einen Spritzenfilter filtriert, fixiert, und bei -80 ° C gelagert. Die Färbung der Virus-Nukleinsäuren für Durchflusszytometrie erfolgte mittels SYBR Green. Weiters untersuchten wir die Veränderung von Thylakoiden und der DNA im zeitlichen Verlauf mittels konfokaler Laserscanning Mikroskopie. Dafür wurden die Proben nach der Fixierung im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert. Thylakoide sind autofluoreszierend; für die DNA-Untersuchung wurde DAPI gefärbt. Die Probenahme wurde zu 8 Zeitpunkten (0, 3, 6, 20, 22, 25, 28, 32 Stunden nach Induktion) durchgeführt. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Histogramme zeigten einen signifikanten Anstieg der Anzahl der Viren nach Induktion mit MMC in Deborah-Proben.Die konfokalen Bilder entsprachen den Ergebnissen der Durchflusszytometrie. Durch die Erhöhung der Anzahl der Viren wurde die Struktur der Thylakoide gestört. Die DNA war auch dichter und befand sich auf einer Seite der Zelle. Intensive Belichtung wird auch als Auslöser der Cyanophageninduktion angenommen und sowohl in Nakuru als auch in Oloidien-Proben stieg die Anzahl der Viren nach fast 24 Stunden an. Außerdem wurde eine Schädigung der Thylakoide beobachtet. Wir beobachteten jedoch auch eine erhöhte Anzahl von Viren und Schädigungen der Thylakoide in den Proben, die bei konstanter Dunkelheit gelagert wurden. Dafür gibt es mehrere Erklärungen. Die erhöhte Anzahl von Viren kann auf das Vorhandensein heterotropher Bakterien zurückzuführen sein, die in der Dunkelheit überleben können. Es gab auch einen anderen Phänotyp eines Cyanobakteriums, der auf die Umweltfaktoren unterschiedlich reagieren kann. Die Schädigung der Thylakoide kann auch auf die Wirkung von Glutaraldehyd als Fixiermittel zurückzuführen sein, das die Ultrastruktur eines Cyanobakteriums beeinträchtigen kann. Unsere Studie zeigt die Wirksamkeit der konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Ultrastruktur von A. fusiformis. Es sind jedoch weitere Versuche notwendig, um axenische Kulturen, sowie die Auswirkungen von Umweltfaktoren und der Fixierungen genauer zu analysieren.

Abstract

(Englisch)

Arthrospira fusiformis is a cyanobacterium occurring in harsh conditions of soda lakes. The characteristics of soda lakes are high temperature, high pH, and high turbidity. A. fusiformis is the main food source for certain species such as Lesser Flamingo (Phoeniconaias minor). Therefore, it is considered a key driver of several ecological cycles. Any fluctuations in population density of A. fusiformis affect flamingo communities and other food webs. The high protein content and non-toxicity of A. fusiformis makes it an eligible candidate for aquaculture to feed, for example, shrimps or the production of food supplements. Cyanophages are viruses infecting cyanobacteria thereby affecting their community composition. The transition from the lysogenic to the lytic cycle (cyanophage induction) is a possible cause of A. fusiformis sudden collapse. In this study, we studied the potential of confocal laser scanning microscopy to detect cyanophage attacks in Arthrospira. We used flow cytometry to detect the cyanophage induction. We received samples collected from the lakes Nakuru and Oloidien, both located in Kenya and one cultivated sample called Deborah after the donator. We used 1.5 mg ml-1 mitomycin (MMC) on Deborah samples to induce prophages. Nakuru and Oloidien samples were treated with 24 hours’ light and 24 hours’ darkness. The samples were filtered, fixed and stored at – 80° C. Staining of nucleic acids of virus particles was done with SYBR green prior to flow cytometry. We scrutinized temporal alteration in thylakoids and the DNA of cyanobacterium by confocal laser scanning microscopy. For this, the samples were stored at room temperature in the darkness after fixation. Thylakoids are autofluorescent but, for DNA scrutiny, DAPI staining was used. The sampling was carried out at 8-time points (0, 3, 6, 20, 22, 25, 28, 32 hours after induction). The outcomes of flow cytometry histograms showed a significant increase in the number of viruses after induction with MMC in Deborah samples. Confocal images corresponded to the results of flow cytometry. By increasing the number of viruses, the structure of thylakoids was disturbed. The DNA was also denser and located on one side of the cell. Intensive light exposure is assumed as a trigger of cyanophage induction. In both Nakuru and Oloidien samples, the number of viruses increased after almost 24 hours. Meanwhile, the damage to the thylakoids was observed. However, we also observed the increased number of viruses and damage to the thylakoids in the samples stored under constant darkness. The increased number of viruses can be as a result of the presence of heterotrophic bacteria which, can survive in the darkness. There was also another phenotype of a cyanobacterium which, can respond differently to the environmental factors. The damage to the thylakoids may also be due to the effect of glutaraldehyde as a fixative which may affect the ultrastructure of a cyanobacterium. The conclusion of our survey indicates the efficacy of confocal microscopy to investigate the ultrastructure of A. fusiformis. However, it calls for more detailed investigations on axenic cultures, the effect of environmental factors and, the effect of fixation.

Autor*innen

Maryamalsadat Zekri

Haupttitel (Englisch)

Use of Flow Cytometry and Confocal Microscopy to Investigate the Infection of Arthrospira fusiformis by Cyanophages

Paralleltitel (Deutsch)

Verwendung von Flow Cytometry und Confocal Mikroskopie zur Untersuchung der Infektion von Arthrospira fusiformis durch Cyanophagen

Publikationsjahr

2019

Umfangsangabe

71 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Ingeborg Lang

Klassifikation

42 Biologie > 42.90 Ökologie: Allgemeines

AC Nummer

AC15550393

Utheses ID

53396

Studienkennzahl

UA | 066 | 833 | |

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