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Metabolic regulation of mitochondrial pathways in oxidative stress
Magdalena Latka
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Carsten Culmsee
DOI
10.25365/thesis.60976
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-17310.30889.487953-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Hintergrund: Angesichts der Tatsache, dass unsere Bevölkerung altert und das Altern der wichtigste Risikofaktor für Neurodegeneration ist, ist es dringend erforderlich, ein besseres Verständnis dafür zu erlangen, wie Nervenzellen sterben und wie dies verhindert werden kann. Es gibt Hinweise darauf, dass Neuronen vor einer nachweisbaren Neurodegeneration mit einem gestörten Stoffwechsel und bioenergetischen Krisen zu kämpfen haben. Mitochondrien spielen eine doppelte Rolle als Hauptenergielieferanten für die energieaufwändigen Neuronen sowie als Richter über Leben und Tod. Mitochondrien
mit beeinträchtigter Dynamik und Defekten der Elektronentransportkette treiben die
Alterungs- und neurodegenerativen Prozesse über Energieentzug, übermäßige reaktive Sauerstoffspezies (ROS)-Bildung und Aktivierung von Zelltodpfaden an. Die endogene Strategie zur Verringerung der ROS-Belastung für Mitochondrien sind Entkopplungsproteine,
die den für die ATP-Synthese verwendeten Protonengradienten zerstreuen, um die ROS-Emission aus der Elektronentransportkette zu minimieren. Die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Struktur und Funktion stellt somit ein Tor zur Neuroprotektion dar. Es ist bekannt, dass die pharmakologische Verringerung der Effizienz der Energieumwandlung, z.B über die Hemmung des Atmungskettenkomplexes I und die Verlagerung der
Glukoseverwertung von der oxidativen Phosphorylierung zur Glykolyse zur Verringerung der oxidativen Belastung der Mitochondrien führt und eine Schutzstrategie unter Bedingungen mit erhöhtem oxidativen Stress darstellt. Solch eine milde Bedrohung des Überlebens
der Zellen macht Zellen und Tiere durch die Aktivierung mehrerer evolutionär konservierter Prosurvival-Pfade gegenüber einem größeren und ansonsten tödlich verlaufenden Stressor widerstandsfähig. Diese Strategie ist auch unter Begriffen wie Vorkonditionierung
und Hormese bekannt. Um diese paradoxen Beobachtungen zu bestätigen oder zu widerlegen, wurde in dieser Arbeit der Atmungskettenkomplex I-Inhibitor Phenformin als neuroprotektiver Wirkstoff gegen Oxytose in HT22-Zellen getestet. Oxytose ist eine Form der regulierten Nekrose, die u.a. im ischämischen, hämorrhagischen und degenerativen Milieu auftritt, wenn die antioxidative Kapazität der Zelle überfordert ist und die durch viele metabolische Prozesse, wie z.B. Veränderungen des Lipid- und Glutaminstoffwechsels sowie der Eisenhomöostase manipulierbar ist.
Methoden: Für die Experimente wurde die murine immortalisierte neuronähnliche HT22-Zelllinie verwendet. Die Auswirkungen von Phenformin auf die Stoffwechselaktivität und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden mit dem MTT-Assay gemessen. Die Proliferationsrate und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden mittels Echtzeit Impedanzmessung
mit dem xCELLigence-System analysiert. Durchflusszytometrische Analysen umfassten die Messung von Lipidperoxiden mit BODIPY, Mitochondrien-Superoxid mit MitoSOX, mitochondrialem Membranpotential mit TMRE und Apoptose/Nekrose mit Annexin
V-FITC/PI-Fluoreszenzfarben.
Resultate: Phenformin zeigte in den durchflusszytometrischen Analysen der Lipidperoxidation, des mitochondrialen Superoxids und der Apoptose sowie in den MTT- und xCELLigence-Experimenten einen vorübergehenden Schutz gegen Glutamat-induzierte Schäden. Eine Vorbehandlung mit Phenformin vor der Exposition mit Glutamat führte
zu länger anhaltenden Schutzeffekten, da das Überleben der Neurone über mindestens 22 Stunden im Vergleich zu etwa 12 Stunden im Cotreatment-Modus aufrechterhalten wurde, was auf erweiterte Schutzmechanismen durch längere Inkubationszeit hinweist.
Weiterhin wurde beobachtet, dass die Hemmwirkung von Phenformin auf die Stoffwechselaktivität sowie auf die Proliferation mit schützendenWirkungen einhergeht. Die leichte Erniedrigung des mitochondrialen Membranpotentials und der leichte Anstieg der mitochondrialen Superoxidspiegel korrelierten ebenfalls mit einer erhöhten Lebensfähigkeit der Zellen.
Schlussfolgerungen: Durch die Behandlung mit Phenformin wurden HT22-Zellen resistenter gegen oxidative Glutamat-Toxizität. Die Auswirkungen auf das mitochondriale Membranpotential und die mitochondrialen Superoxidspiegel deuten auf eine direkte Wirkung von Phenformin auf Mitochondrien hin. Unter Berücksichtigung der zahlreichen Forschungsarbeiten zu anderen auf Mitochondrien gezielten, Oxytose verhindernden Wirkstoffen könnte man den durch Phenformin bewirkten Schutz neben anderen möglichen Wirkungsmechanismen auch der Komplex-I-Hemmung zuschreiben.
Abstract
(Englisch)
Background: Bearing in mind that our population is aging and that aging is the most important risk factor for neurodegeneration, there is an urgent need for achieving a better understanding how nerve cells die and how this can be prevented. There is emerging evidence that prior to detectable neurodegeneration neurons struggle with dysregulated metabolism and bioenergetic crises. Mitochondria play a dual role as main energy suppliers for the high energy demanding neurons as well as judges over life and death. Mitochondria with impaired dynamics and acquired electron transport chain defects drive
the aging and neurodegenerative processes via energy deprivation, excessive formation of reactive oxygen species (ROS) and activation of cell death pathways. The endogenous strategy to decrease the ROS burden for mitochondria are uncoupling proteins, that dissipate the proton gradient used for ATP synthesis in order to minimize ROS emission from the electron transport chain. Thus, sustaining mitochondrial structure and function represents a gateway to neuroprotection. The pharmacological reduction of the efficiency
of energy conversion, e.g. by inhibition of respiratory chain complex I and by shifting glucose utilization from oxidative phosphorylation to glycolysis in order to decrease the oxidative burden for the mitochondria has been shown to be a protective strategy under
increased oxidative stress conditions. Such a mild threat to the cells’ survival renders cells and animals resilient towards a greater and otherwise fatal stressor via activation of several evolutionary conserved prosurvival pathways, a strategy also known under terms like preconditioning and hormesis. In order to confirm or disprove these paradoxical observations, in this thesis respiratory chain complex I inhibitor phenformin was tested as a neuroprotective agent against oxytosis in HT22 cells. Oxytosis is a form of regulated necrosis, occuring in an ischemic, haemorrhagic and degenerative environment when the antioxidant capacity of the cell is overwhelmed, and is susceptible to changes of lipid, glutamine and iron metabolism, among others.
Methods: For the experiments the murine immortalized neuron-like HT22 cell line was used. Effects of phenformin on metabolic activity and cell viability were measured with the MTT assay. Proliferation rate and cell viability was analysed via real-time impedance measurement with the xCELLigence System. Flow cytometric analyses included the measurement of lipid peroxides with BODIPY, mitochondrial superoxide with MitoSOX, mitochondrial membrane potential with TMRE and apoptosis/necrosis with Annexin V-FITC/PI fluorescent dyes.
Results: Phenformin showed transient protection against glutamate-induced damage in the flow cytometric analyses of lipid peroxidation, mitochondrial superoxide and apoptosis and in the MTT and xCELLigence experiments. A pretreatment with phenformin
before glutamate exposure lead to longer-lasting protective effects, as survival of neurons was maintained through at least 22 h of exposure to glutamate compared to around 12 h in cotreatment mode, indicating expanded protective mechanisms with longer incubation time. Furthermore, the inhibiting effects of phenformin on metabolic activity as well as on proliferation were observed to go hand in hand with protective effects. The mild lowering effect on mitochondrial membrane potential and slight increase of mitochondrial superoxide levels also correlated with increased cell viability.
Conclusions: Phenformin treatment rendered HT22 cells more resistant against oxidative glutamate toxicity. The effects on mitochondrial membrane potential and on mitochondrial superoxide levels indicate direct action of phenformin on mitochondria. Taking into
consideration the body of research on other mitochondria-targeted oxytosis-preventing agents, one might attribute the protection rendered by phenformin to complex I inhibition, among other possible mechanisms of action.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
oxytosis ferroptosis phenformin neuroprotection mitochondria complex I inhibition mitochondrial membrane potential
Schlagwörter
(Deutsch)
Oxytose Ferroptose Phenformin Neuroprotektion Mitochondrien Komplex I-Hemmung mitochondriales Membranpotential
Autor*innen
Magdalena Latka
Haupttitel (Englisch)
Metabolic regulation of mitochondrial pathways in oxidative stress
Paralleltitel (Deutsch)
Metabolische Steuerung von mitochondrialen Pathways bei oxidativem Stress
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
XII, 54 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Carsten Culmsee
AC Nummer
AC15614695
Utheses ID
53872
Studienkennzahl
UA | 449 | | |