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Structural insigths into the collagen-fibronectin interaction
Barbara Sladek
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Timothy Skern
DOI
10.25365/thesis.6036
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29920.82256.957270-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Mein Name ist Barbara Sladek. Nachdem ich den Großteil meines Studiums an der Universität Wien erfolgreich absolviert habe, studiere ich seit September 2008 in Oxford, Großbritannien. Im Moment schreibe ich an meiner Diplomarbeit im Fach Molekularer Biologie. Ich arbeite in der Gruppe von Professor Iain D. Campbell, Universität von Oxford, Biochemistry Department. Drs. Ioannis Vakonakis und Michèle Erat sind meine direkten Supervisors. Ziel meiner Diplomarbeit ist die Analyse der Interaktion von Fibronectin und Collagen Typ 1 sowie das Gewinnen neuer Einsichten in diese Bindung.
Beide Proteine sind essentielle Bestandteile der extrazellulären Matrix und spielen im Wachstum,bei der Krebs-Tumor Progression sowie beim Aufbau und der Heilung von Wunden eine große Rolle. Collagen hat zwei α1 und einen α2 Stränge. An jedem wurden zwei Bindungsseiten für Fibronectin gefunden. Diese beiden Interaktionsseiten werden collagenase-site und 260-site genannt. Während meiner Arbeit untersuchte ich im Speziellen die Bindung dieser vier Seiten – collagenase-site-α1, collagenase-site-α2, 260-site-α1 and 260-site-α2 - mit dem Fibronectin Fragment 8-9FnI. Die Interaktionen wurden mittels Nuclear Magnetic Resonance (NMR) und x-ray Kristallographie untersucht. Als Neben-Projekt versuchte ich ein tripel-helikales Collagenpeptid eigenständig herzustellen.
Aus der Interaktions-Analyse konnten drei wichtige Schlussfolgerungen gezogen werden. Zuerst wurde die Interaktion von Collagen Typ 1 α2-Stang mit dem 8-9FnI-Fragment mittels NMR analysiert. Man konnten eine sehr schwache Bindung beider Interaktionsseiten zu Fibronectin feststellen. Sodann wurde die Interaktion zwischen Collagen Typ 1 260-site-α1 8-9FnI-Fragment charakterisiert. Für die Struktur-Determination und der Feststellung der Stärke der Bindung wurden Methoden der NMR und der X-ray Kristallographie angewendet. Jene Interaktion beeinflusst die Fibronectin-Collagen Bindung. Es liegt eine schwache Bindung vor. Die Struktur konnte auf Grund von Kristallen, bei einer Auflösung von 2.6Å und mittels molecular replacement gelöst werden (Abbildung 1). Dr. Ioannis Vakonakis beschäftigte sich schon länger mit der Interaktion von Fibronectin in der extrazellulären Martix. So konnten Drs. Ioannis Vakonakis und Michèle Erat bereits die Struktur des Interaktions-Komplexes collagenase-site-α1 mit 8-9FnI determinieren (Erat, Slatter et al. 2009). Ich nutzte diese Information und verwendetes sie für molecular replacement. Ferner untersuchte ich den Interaktions-Komplex collagenase-site-α1 mit 8-9FnI. Hier liegt, wie bereits untersucht, eine starke Bindung vor. Bis jetzt war jedoch noch nicht klar, weshalb diese Bindung so stabil sei. Mittels NMR-Untersuchungen und Fluorescence Anisotropie Messungen konnte verifizieren werden, dass es sich um eine sequenzielles Phänomen handelt. Die hydrophobe Aminosäure Valin 273 ist hierfür verantwortlich.
Als zweites Projekt versuchte ich ein tripel-helikales Collagenpeptid mittels Methoden der Polymerase-Chain-Reaction (PCR), bakterieller Expression und diverser Aufreinigungs-Schirtte herzustellen. Ziel war der Versuch schnell und kostengünstig diese Peptide herzustellen um sie später für NMR-Analysen zu verwenden. Dies gelang und es konnte mittels Circular Dichrosim (CD) uns Massenspektroskopie-Analysen die tripel-helikale Formation nachweisen.
Abstract
(Englisch)
The overall aim of this thesis is to analyse the interaction sites on collagen type 1 with FN to gain new detailed structural insights into their interactions. Fibronectin (FN) and collagen belong to the most abundant members of the extracellular matrix and play important roles in growth, development, repair, and cancerous tumour progression (Kleinman and McGoodwin 1976; Barilla and Carsons 2000; Perumal, Antipova et al. 2008). Although their interaction has been mentioned in literature as early as 1977 (Engvall and Ruoslahti 1977; Dessau, Sasse et al. 1978; Kleinman, McGoodwin et al. 1978), until recently no structure of the complex has been available, and thus, details of this interactions have remained unclear.
Recently, Erat et al. showed that the collagen type 1 α1 chain makes a tight complex with the 42 kDa gelatin-binding domain (GDB) in FN by solving the X-ray structure of a complex of 8-9FnI bound to a collagen peptide of 23 amino acids to a resolution of 2.1Å (Erat, Slatter et al. 2009). Collagen type 1 consists of two α1 and one α2 chain. By looking closer onto collagen type 1, two interaction sites were found on each α chain, called collagenase-site and 260-site.
We found out that the interaction of FN with collagenase-site is tighter than with the 260-site. The reason for that is that the starting-sequence for the collagenase-site, in both chains, is more hydrophobic and therefore it is more suitable for interaction. According to the collected data it is easy to see that the so-called 260-site-α2, undergoes weak binding with 8-9FnI.
Furthermore, we report a defined interaction of 8-9FnI with the 260-site (G254 – Y277) of collagen type 1 α1 chain. This was characterised using NMR and X-ray. We were able to crystallise the interaction complex at a resolution of 2.6Å. The structure was then determined by using molecular replacement. The overall conformation of the collagen type 1 260-site-α1 peptide is similar to the one with the collagenase-site-α1 (Erat, Slatter et al. 2009). The main differences between these two structures are two valines, which are interacting with 9FnI. Closer examination showed that these two valines, V782 and V783, are responsible for the tight interaction of 8-9FnI with the collagenase-site in collagen type 1. These two residues cannot be detected at any of the 260-sites in collagen type 1. So our conclusion is that it is a sequential phenomenon.
As a side project we managed to produce a collagen type 1 peptide, which was mostly folded correctly in a triple-helical conformation. The idea was to be able to produce labelled peptide for NMR studies.
So basically during my work we concentrated on the characterisation of the interaction between 8-9FnI and collagen type 1. We characterised two new binding sites and also looked closer at another two, which were already studied by Erat et al. (Erat, Slatter et al. 2009). Additionally, we pointed out the possibility to produce one triple helical peptide on our own.
With this thesis I hope to gain a deeper insight into complex binding of FN with collagen type 1.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Collagen Fibronectin NMR Crystallography Extracellular Matrix ECM
Schlagwörter
(Deutsch)
Collagen, Fibronectin NMR Kristallographie Extrazelluläre Matrix
Autor*innen
Barbara Sladek
Haupttitel (Englisch)
Structural insigths into the collagen-fibronectin interaction
Paralleltitel (Deutsch)
Strukturelle Einblicke in die Interaktion zwischen Collagen und Fibronectin
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
144 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Timothy Skern
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC08277207
Utheses ID
5423
Studienkennzahl
UA | 490 | | |