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A peek inside the droplet: analyzing the principles that drive liquid-liquid phase separation of FUS RGG3-PY (454-526)
Benjamin Frühbauer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Bojan Zagrovic
Mitbetreuer*in
Anton Polyansky
DOI
10.25365/thesis.61406
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-14733.00357.818654-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Bestimmte Biomoleküle können sich in der Zelle zu sogenannten biomolekularen Kondensaten zusammenschließen, ein Phänomen, welchem in den letzten Jahren vermehrt Aufmerksamkeit geschenkt wurde, und dessen Relevanz im Zuge dessen neu evaluiert wurde. Das Resultat ist eine Vielzahl wissenschaftlicher Publikationen zu diesem Thema, einige davon über das Phasenverhalten ausgewählter Moleküle, andere mit dem Ziel den theoretischen Hintergrund, der zu solchen Prozessen führt, ans Licht zu bringen. Die durch Phasentrennung gebildeten, nicht Membran-gebundenen Organellen konnten mittlerweile in fast allen Bereichen eukaryotischer Zellen gefunden werden, wobei nach und nach vermehrt pathologische Instanzen festgestellt wurden. Das Protein “fused in sarcoma” (FUS) spielt zum Beispiel eine Rolle in der Entwicklung amyotropher Lateralsklerose (ALS) und anderer neurodegenerativer Erkrankungen. FUS ist normalerweise weitgehend im Zellkern lokalisiert, im Zusammenhang mit ALS wurde allerdings die vermehrte Präsenz FUS-assoziierter Kondensate festgestellt.
Die Durchführung detaillierter Untersuchung der Vorgänge die zur Phasentrennung ungeordneter Proteine führen ist problematisch, vor allem im sub-nanometer großen Bereich. Klassische Techniken der Strukturbiologie sind hierbei davon abhängig, dass das Verhalten einer Vielzahl von Molekülen über zumindest mehrere Millisekunden gemittelt wird. Die Interaktionen, die das Netzwerk biomolekularer Kondensate bilden, sind allerdings derart flüchtig, dass eine experimentelle Untersuchung beinahe unmöglich wird. Die C-terminale Region des FUS Proteins, RGG3-PY, hat eine Länge von nur 73 Aminosäuren und ist dazu fähig im in vitro Experiment mit sich selbst eine Phasentrennung einzuleiten. Die Zusammensetzung dieser Region ist mit vielen anderen Abschnitten des FUS Proteins vergleichbar, und die relativ kurze Länge erlaubt die Anwendung biomolekularer Simulationen um das Verhalten des Proteins mittels eines computergestützten Modells zu studieren.
Entscheidende Verbesserungen in der Modellierung von Wasser in solchen Simulationen, in Kombination mit etablierten Force Fields (Sammlung von Parametern die zur Errechnung von Energien als Basis der Simulation verwendet werden) konnten in den vergangenen Jahren große Erfolge in der Simulation von intrinsisch ungeordneten Proteinen (intrinically disordered proteins; IDPs) verzeichnen. Der Zweck dieser Studie lag darin, sich diese Entwicklungen zunutze zu machen um das Verhalten von RGG3-PY im Inneren eines Kondensates, bei hoher zeitlicher Auflösung zu simulieren. Die erzielten Ergebnisse bezeugen ein reichhaltiges, dynamisches Verhalten des Proteins, sowohl isoliert in Lösung, als auch im hoch konzentrierten System (~89 mg/mL). Im Einzelnen konnten Analysen der strukturellen und dynamischen Parameter der simulierten Moleküle durchgeführt werden, inklusive deren Trägheitsradii, Diffusionskoeffizienten und Valenzklassen. Der Wert der durch diese Simulationen generierten Daten kulminiert in der Identifikation des DRGGF/Y Motivs, von dem eine entscheidende Rolle in der Phasentrennung der RGG3-PY Region angenommen werden kann.
Diese Arbeit enthält einen der ersten je gewagten Versuche das Innere eines biomolekularen Kondensats in einem Mikrosekunden umfassenden Umfang auf atomarer Ebene zu simulieren. Die Ergebnisse konnten dabei einzelne Aspekte vereinfachter Modelle zur Phasentrennung widerspiegeln, und dadurch die theoretische Basis ihrer Relevanz bei solchen Prozessen weiter verstärken.
Abstract
(Englisch)
The relevance of liquid-liquid phase separated biomolecular condensates in the cell has attracted increasing attention during recent years, resulting in an abundance of publications that describe the phase behaviour of specific molecules or try to establish a theoretical framework to better understand the mechanism that produces this functionally versatile macromolecular phenomenon. Such membrane-less organelles have been identified in virtually every sub-compartment of eukaryotic cells, and they have been increasingly recognized to be involved in a number of disease pathways. Fused in sarcoma (FUS), for example, is a largely disordered protein that phase-separates and has been associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and other neurodegenerative diseases. Its exact role in harming the cells has not yet been conclusively elucidated, but the malformation of FUS-containing biomolecular condensates has consistently been associated with pathological developments.
Studying the mechanisms that drive phase separation of disordered biomolecules at an atomic level has encountered several obstacles in the past, as many methods that investigate structural aspects of protein behaviour rely on averaging over an ensemble of many molecules over at least millisecond-long periods of time. The transient, dynamic formation of unstable contacts that underlie the macroscopic network of biomolecular condensates can therefore not usually be captured with sufficient resolution. The 73-residue long C-terminal region of FUS, termed RGG3-PY, has recently been observed to undergo phase separation on its own in vitro. The sequence of this protein region represents the characteristics of large parts of the protein, while its length still allows the application of molecular dynamics (MD) simulations to investigate its behaviour computationally.
Recent advances in the parameters that are used to model the behaviour of water, combined with the power of well-established protein force fields have been shown to allow accurate modelling of disordered ensembles on the atomistic level. This study makes use of state-of-the-art, multi-copy MD simulations to investigate the microscopic behaviour of RGG3-PY at high concentration on a microsecond time scale. The simulated trajectories reveal a rich, dynamical behaviour of this intrinsically disordered protein region of low complexity, both at infinite dilution and an effective concentration of ~89 mg/mL. Specifically, a characterization of the structural, dynamical and rheological properties of the simulated proteins was conducted, including their radii of gyration, estimated diffusion coefficients, and multivalency. Importantly, key interaction sites in the RGG3-PY sequence were analysed, resulting in the identification of a DRGGF/Y motif, which may be the overall driver of FUS RGG3-PY’s phase separation.
Overall this work presents some of the first-ever attempts to simulate the interior of a phase-separated biomolecular condensate using microsecond-level MD simulations, and provides support for the predictions of simplified models of polymer liquid-liquid phase separation such as that of patchy polymers.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
molecular dynamics simulation FUS protein liquid-liquid phase separation biomolecular condensates RGG-rich region
Schlagwörter
(Deutsch)
molecular dynamics Simulation FUS Protein Flüssig-Flüssig Phasentrennung biomolekulare Kondensate RGG-reiche Proteinregion
Autor*innen
Benjamin Frühbauer
Haupttitel (Englisch)
A peek inside the droplet: analyzing the principles that drive liquid-liquid phase separation of FUS RGG3-PY (454-526)
Paralleltitel (Deutsch)
Eine Analyse der Eigenschaften, die zur Flüssig-Flüssig-Phasentrennung von FUS RGG3-PY (454-526) beitragen
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
IV, 51 Seiten : Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Bojan Zagrovic
AC Nummer
AC15652375
Utheses ID
54262
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |