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Extraction of genomic DNA from formalin-fixed and ethanol-fixed, long-term stored museal tissue with regard to SNP analysis in foetuses with otocephaly-dysgnathia complex
Christina Wagner
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
DOI
10.25365/thesis.62667
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-16293.34479.708968-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Mit einer Häufigkeit von 1 in 70 000 Geburten zählt Otozephalie zu den seltenen Erkrankungen. Aufgrund der begrenzten Anzahl an Patienten sind die genetischen Faktoren, die zur Entwicklung von Otozephalie führen, bis heute noch wenig erforscht. Seit Jahrzehnten werden Fixierungsmethoden zur Erhaltung der Integrität von Geweben angewendet und repräsentieren eine unverzichtbare Ressource für genomische Untersuchungen.
Die Masterarbeit hatte zum Ziel, verschiedene Methoden zur Extraktion von genomischer DNA aus Formalin- oder Ethanol-fixiertem, fetalem Gewebe hinsichtlich Ausbeute, Reinheit, PCR Amplifizierbarkeit und Eignung zu Analyse von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zu vergleichen.
Um die DNA bestmöglich zu extrahieren, wurden folgende Parameter der DNA Extraktionsprotokolle untersucht: DNA Extraktionsmethode, Behandlung der Proben vor dem Gewebeverdau und Lysedauer. Die Konzentration und Reinheit der erhaltenen DNA wurden mittels Spektrophotometer bestimmt, wobei die Konzentration zusätzlich noch fluorimetrisch ermittelt wurde. Genabschnitte, die potenzielle SNPs von Interesse enthielten, wurden amplifiziert, mittels real-time PCR analysiert und sequenziert.
Die Ergebnisse zeigten, dass die DNA Konzentrationen im Allgemeinen niedrig waren. Die DNA Ausbeute konnte durch die Rehydratisierung des Gewebes vor der Lyse, den Einsatz von hohen Proteinase K Konzentrationen in Kombination mit Lyse über Nacht und einem Erhitzungsschritt für die Umkehr von Formaldehyd-Modifikationen verbessert werden. Dennoch konnten die DNA Extrakte nicht reproduzierbar amplifiziert werden. Auch die DNA, welche aus dem Gewebe der Föten mit ODC isoliert wurde, konnte nicht amplifiziert werden, weshalb in weitere Folge die Bestimmung des Genotyps nicht möglich war. Dennoch konnten bei den wenigen amplifizierten DNA Extrakten von den gesunden Föten die DNA Sequenz und somit der SNP von Interesse bestimmt werden.
Abstract
(Englisch)
Otocephaly-Dysgnathia Complex (ODC) occurs 1 in 70 000 births only and is therefore considered a rare disease. Since the number of patients is limited, the genetic mechanisms underlying the evolvement of ODC are widely unknown. For decades fixation has been used for maintaining the integrity of tissues. Therefore, fixed and long-term preserved museum specimens are an indispensable resource for genomic studies.
In this study, several methods for DNA extraction from formalin- or ethanol-fixed foetal tissues were compared. The extracted DNA was characterised with regard to yield, purity, PCR amplifiability and suitability for single nucleotide polymorphism (SNP) analysis.
In order to gain access to the cross-linked DNA, following parameters of DNA extraction protocols were investigated: DNA extraction method, pre-treatment of the samples prior to lysis and lysis duration. DNA purity was determined by spectrophotometric measurements while DNA yield was additionally assessed with a fluorometric assay. Regions containing candidate SNPs were amplified and analysed by real-time PCR. The obtained PCR products were further analysed by pyrosequencing.
In general, DNA concentrations were rather low. The highest DNA yield was obtained from formalin-fixed tissue using an organic solvent-based approach. Tissue rehydration, the use of high proteinase K concentrations in combination with overnight lysis and a formaldehyde-modification-reversal step improved DNA extraction. DNA isolated from tissue from foetuses with ODC could not be amplified. Consequently, the determination of the genotype failed. However, the few amplified DNA extracts from the healthy foetuses could successfully be sequenced and the SNP of interest determined.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
DNA extraction formalin-fixed tissue museal specimen Otocephaly-Dysgnathia Complex
Schlagwörter
(Deutsch)
DNA Extraktion Formalin-fixiertes Gewebe Museumsproben Otozephalie
Autor*innen
Christina Wagner
Haupttitel (Englisch)
Extraction of genomic DNA from formalin-fixed and ethanol-fixed, long-term stored museal tissue with regard to SNP analysis in foetuses with otocephaly-dysgnathia complex
Paralleltitel (Deutsch)
Extraktion genomischer DNA aus Formalin-fixiertem und Ethanol-fixiertem, lange Zeit konserviertem Gewebe von Museumsproben in Bezug auf SNP Analysen in Föten mit Otozephalie
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
XI, 117 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Margit Cichna-Markl
AC Nummer
AC16126668
Utheses ID
55381
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |