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A new immunogene therapy approach inducing tumor eradication by a non-viral plasmid vector encoding for a secreting SIRPα-Fc fusion protein (sCV1-hIgG1) targeting CD47
Magdalena Billerhart
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus d. Bereich Lebenswissenschaften (DissG: Pharmazie)
Betreuer*in
Manfred Ogris
DOI
10.25365/thesis.69439
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-31388.54177.523415-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Es ist ein Malignitätsmerkmal von Krebszellen sich vor dem Immunsystem zu tarnen und somit vor dessen Elimination zu schützen. Die Inhibierung sog. Immuncheckpoints und die damit verbundene Aktivierung von Immunzellen stellt somit einen attraktiven Behandlungsansatz in der Krebsimmuntherapie dar.
In dieser Arbeit wurde ein Immunogentherapieansatz entwickelt, der primäre Immunzellen wie Makrophagen, Dendritische Zellen (DCs), Neutrophile und natürliche Killerzellen (NK Zellen) dazu anregen soll, Krebszellen zu erkennen und zu eliminieren. Dabei fokussierten wir uns auf den Immuncheckpoint CD47. Dieser ubiquitär exprimierte Transmembranrezeptor ist auf Krebszellen hochreguliert und dient dort als „Don't eat me" Signal, das die Elimination durch Phagozytose verhindert, indem CD47 an seinen Liganden SIRPα an Makrophagen und DCs bindet. Wir entwickelten einen neuen therapeutischen Plasmidvektor psCV1-hIgG1, der für das sezernierende Fusionsprotein sCV1 hIgG1 kodiert. Dieser beinhaltet die Sequenz des IL-2 Signalproteins (s) zur Sekretion des Fusionsproteins aus der transfizierten Krebszelle, sowie eine hoch-affine CD47 blockierende SIRPα Variante (CV1), die an eine humane IgG1 Fc Region gekoppelt wurde (hIgG1). Das Fusionsprotein entfaltet seine volle Wirkung durch lokale Expression in Krebszellen und Bindung an CD47 auf der Oberfläche transfizierter, aber auch benachbarter Krebszellen (Bystander-Effekt), wodurch die Transfektionseffizienz erhöht und Nebenwirkungen in Nicht-Zielorganen reduziert werden sollen. Während die CV1-Domäne CD47 blockiert, ermöglicht die Fc-Region die Fc Rezeptor- und Komplement-vermittelte antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP), antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) und komplementabhängige Zytotoxizität (CDC).
Mittels Immunfluoreszenz-Färbung gelang es, sCV1-hIgG1-Expression, -Sekretion und CD47-Blockierung auf CD47-exprimierenden Triple-negativen Brustkrebszellen (TNBC) in vitro nachzuweisen, die mit psCV1 hIgG1 und linearem Polyethylenimin (LPEI) trasnfiziert wurden. Auch den Bystander-Effekt sowie die anhaltende transiente Transfektion und sCV1-hIgG1-Sekretion über ca. zwei Wochen war klar messbar. Den Tumor-dezimierenden Effekt konnten wir in vivo mittels Implantation von ex vivo transfizierten sCV1 hIgG1-sezernierenden 231/LM2-4-EGFPluc Brustkrebszellen in CB17-SCID Mäusen unter Beweis stellen. Tumorwachstumsanalysen mit Hilfe von 2D bioluminescence imaging (BLI) und die anschließende Tumorentnahme zeigten reduziertes Tumorwachstum und sogar das vollständige Verschwinden von einem Drittel aller Tumore. Weiter konnten wir eine Infiltration von Makrophagen 17 Stunden nach intratumoraler Administration von LPEI-Polyplexen beladen mit psCV1-hIgG1, feststellen. Ebenso vermuten wir die Mitwirkung von NK-Zellen beim Tumorrückgang, da wir NK-zell-mediierte Zelllyse von co-kultivierten psCV1-hIgG1-transfizierten Krebszellen in vitro feststellen konnten.
Der Vorteil unseres Vektors ist eine robuste und anhaltende transiente Transfektion, die einen enormen Bystander-Effekt erzeugt, der die niedrige Transfektionseffizienz von nicht-viralen Vektoren kompensiert.
Abstract
(Englisch)
While a hallmark of cancer is to hide from the immune system, re-activation of immune cells by inhibition of these immune checkpoints displays an attractive target for cancer immunotherapy.
In this work an immunogene therapy approach was developed, which stimulates primary immune cells such as macrophages, dendritic cells (DCs), neutrophils and natural killer (NK) cells to recognize and eliminate cancer cells by targeting the immune checkpoint CD47, a ubiquitously expressed receptor upregulated on cancer cells. CD47 serves as a “marker of self” or “don’t eat me signal” preventing phagocytosis by binding to its ligand SIRPα expressed on macrophages and DCs. Therefore, we designed a new plasmid-based therapeutic gene vector psCV1-hIgG1 encoding for the fusion protein sCV1-hIgG1. It consists of an IL-2 secretion signal sequence (s) necessary for fusion protein secretion outside the transfected cell and a high-affinity CD47-binding SIRPα variant (CV1), which is coupled to a human IgG1 engineered Fc region (hIgG1). Our therapeutic plasmid unleashes its full therapeutic effect by locally sCV1 hIgG1-expression in cancer cells as wells as its secretion and binding to CD47 on the surface of transfected- but also adjacent cancer cells (bystander effect) thereby increasing transfection efficacy and reducing side effects in non-target organs. While the CV1 domain blocks CD47, the Fc region enables Fc receptor- and complement-mediated antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC).
With immunofluorescence staining, we demonstrated successful transient transfection using linear polyethylenimine (LPEI) loaded with psCV1-hIgG1 and confirmed sCV1-hIgG1 expression, secretion and CD47-blockage on CD47-expressing triple-negative breast cancer (TNBC) cells in vitro. The persisting sCV1 hIgG1-secretion over approximately two weeks and the bystander effect was confirmed by further cultivation of cells and the transfer of supernatant containing sCV1-hIgG1 onto a new cell layer. We could further show the tumor restricting effect in vivo by implantation of ex vivo transfected, sCV1-hIgG1-secreting 231/LM2-4-EGFPluc cells into CB17-SCID mice. Reduced tumor growth was recorded via 2D bioluminescence imaging (BLI) and tumor size examination after harvesting, showing eradication of one third of the tumors. Tumor infiltration of macrophages were observed 17 h after intratumoral administration of LPEI-based nanoparticles loaded with psCV1-hIgG1. Moreover, a contribution of NK cells to tumor decline can be assumed. The assumption of NK cell-contribution was further encouraged by receiving NK cell-mediated cell lysis of co-cultured sCV1-hIgG1-secreting cells in vitro. Our immunogene therapy approach reveals a local, robust and sustained transient transfection generating a tremendous bystander effect that compensates low transfection efficiency of non-viral vectors.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
gene therapy plasmid fusion protein marker of self immune checkpoint macrophages NK cells opsonization bystander effect CD47 SIRPa bioluminescence
Schlagwörter
(Deutsch)
Gentherapie Plasmid Fusionsprotein Selbstmarker Immuncheckpoint Makrophage NK Zellen Opsonisierung Bystander-Effekt CD47 SIRPα Biolumineszenz
Autor*innen
Magdalena Billerhart
Haupttitel (Englisch)
A new immunogene therapy approach inducing tumor eradication by a non-viral plasmid vector encoding for a secreting SIRPα-Fc fusion protein (sCV1-hIgG1) targeting CD47
Paralleltitel (Deutsch)
Ein neuer Immunogentherapieansatz, der die Tumoreradikation durch einen nicht-viralen Plasmidvektor induziert, der für ein sezernierendes SIRPα-Fc-Fusionsprotein (sCV1-hIgG1) kodiert, das auf CD47 a
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
142 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Anja Ehrhardt ,
Wolfgang Mikulits
AC Nummer
AC16419409
Utheses ID
55759
Studienkennzahl
UA | 796 | 610 | 449 |