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Establishment of an enhanced CRISPR repressor platform in haploid mouse embryonic stem cells
Kemal Can Arat
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie
Betreuer*in
Martin Leeb
DOI
10.25365/thesis.78483
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-15558.53467.966289-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Obwohl die meisten verfügbaren genetischen Screenings erfolgreich sind, gibt es Einschränkungen in ihren Ansätzen. Insbesondere konzentrieren sich die meisten verfügbaren CRISPR-Screening-Bibliotheken nur auf Protein-kodierende Gene, die nur etwa 2 bis 5% der Säugetiergenome ausmachen. Diese Screenings können jedoch nicht die Funktion von Genclustern, Enhancer-Clustern oder vor allem unbekannten genetischen regulatorischen Elementen abfragen. Daher bleibt der Rest des Genoms nicht nachweisbar.
In diesem Projekt stellen wir einen Ansatz vor, der dieses spezielle Problem aller genomweiten Screening-Technologien löst und uns daher dazu veranlasst, die Genomfunktion umfassender und zuverlässiger zu untersuchen. Die ultimative Aufgabe dieses Projekts besteht darin, Prototypen haploider embryonaler Mausstammzellen (mESC) für ein innovatives genomweites Screeningsystem zu generieren, indem Insertionsmutagenese mit einer fortschrittlichen CRISPR / Cas9-System-basierten Rekrutierung der epigenetischen Silencing-Maschinerie kombiniert wird. Die zweitwichtigste Aufgabe besteht dann darin, die Funktionalität des Prototyps zu validieren. Wir müssen den Bereich der Insertionsmutagenese bestimmen. Dazu werden wir uns die Levels von H3K9me3 ansehen, die am meisten erwartete Histonmodifikation, die vom System verursacht wird. Durch die Analyse des Silencing-Bereichs können wir die Leistung der Silencing-Maschinerie innerhalb der Prototyp-Zelllinien bewerten. Der Prototyp erfordert drei genetische Komponenten, die gleichzeitig in einer haploiden mESC-Linie exprimiert werden. Diese Komponenten sind dCas9-KRAB-MeCP2-transgene, multiple spezifische Guide-RNAs (gRNA) und die Heterochromatinisierungs-Landeplattform (HLP).
Um zu beobachten, ob der Silencing-Mechanismus erfolgreich eingerichtet werden kann, haben wir zunächst einen einfachen diploiden mESC-Prototyp hergestellt. Die vorläufige Überwachung dieses Prototyps ergab, dass mit Ausnahme des Problems der gRNA-Effizienz das Arbeitssystem in den diploiden mESCs generiert werden könnte.
Als nächstes haben wir das Problem der gRNA-Effizienz durch die Erzeugung eines einzelnen Vektors für mehrere gRNAs gelöst und die Silencing-Maschinerie in haploiden mESCs durch Generierung von 3 verschiedenen Prototypen etabliert. Als vorläufige Überwachung haben wir mittels Western Blot und Durchflusszytometrie die Funktionalität des Systems überprüft. Später wurde die Stummschaltung des Systems umfassend überwacht. Wir haben zuerst die Integrationsstellen der HLPs innerhalb des Genoms des Prototyps lokalisiert. Dann analysierten wir den Silencing-Bereich der HLPs und beobachteten ihre Auswirkungen auf die Genomregionen in der Nähe, indem wir die epigenetische Modifikation von H3K9me3 untersuchten. Darüber hinaus analysierten wir die Expressionsmuster der Gene auf und in der Nähe des HLP. Nach einer Reihe von ChIP- und qPCR-Experimenten konnten wir die Fähigkeit des Systems zur Stummschaltung und damit die Fähigkeit der Prototypen verstehen. Am Ende kamen wir zu dem Schluss, dass ein funktionierender haploider Prototyp erfolgreich hergestellt wurde und der Silencing-Bereich dieses Prototyps im Sinne einer Vorreiterrolle für fortschrittliche haploide Prototypen sehr vielversprechend war.
Später, um kontrollierbarere und sicherere Silencing-Maschinen zu etablieren, haben wir die Art der Integration des dCas9-KRAB-MeCP2-Transgens verbessert, indem wir einen Vektor mit einem chemisch induzierbaren Merkmal und einer anderen Integrationsmethode erzeugt haben. Danach war das nächste Ziel die Etablierung des fortschrittlichen haploiden mESC-Prototyps. Leider ist unser Versuch aufgrund einiger experimenteller Probleme mit der Zellploidie gescheitert. Für zukünftige Versuche könnten wir jedoch die genetischen Komponenten entwickeln und produzieren, die für die Schalldämpfungsmaschinerie benötigt werden.
Obwohl wir bis zur Herstellung des fortschrittlichen haploiden mESC-Prototyps noch einen weiten Weg vor uns haben, könnten wir während des gesamten Projekts ein Verständnis dafür vermitteln, wie der Silencing-Mechanismus in den Testprototypen eingerichtet werden kann, und die Leistungsfähigkeit innerhalb des Silencing-Mechanismus darlegen.
Abstract
(Englisch)
Even though most of the available genetic screens are successful, there are limitations in their approaches. Especially, most available CRISPR screening libraries focus on only protein coding genes, which make up only approximately 2 to 5% of mammalian genomes. However, these screens cannot interrogate the function of gene clusters, enhancer clusters, or most importantly, as yet unknown genetic regulatory elements. Therefore, the rest of the genomes remain undetectable.
In this project, we present an approach, which solves this particular problem of all genome-wide screening technologies and therefore, leads us to investigate genome function in a wider and reliable manner. The ultimate task of this project is to generate haploid mouse embryonic stem cell (mESC) prototypes for an innovative genome-wide screening system by combining insertional mutagenesis with an advanced CRISPR/Cas9 system based recruitment of the epigenetic silencing machinery. The second most important task is then to validate the prototype’s functionality; we have to determine the range of the insertional mutagenesis. For this, we will be looking at the levels of H3K9me3, the most expected histone modification caused by the system. By analysing the silencing range, we will be able to evaluate the power of the silencing machinery within the prototype cell lines. The prototype requires three genetic components expressed simultaneously in one haploid mESC line. These components are dCas9-KRAB-MeCP2 transgene, multiple specific guide RNAs (gRNA) and the heterochromatinization-landing platform (HLP).
First, in order to observe if the silencing machinery would be established successfully, we produced a simple diploid mESC prototype. The preliminary monitoring on this prototype stated that, except for the gRNA efficiency issue, the working system could be generated in the diploid mESCs.
Next, overcoming the gRNA efficiency issue by generating a single vector for multiple gRNAs, we established the silencing machinery in haploid mESCs by generating 3 different prototypes. As the preliminary monitoring, via Western blot and flow cytometry, we verified the system’s functionality. Later broad monitoring was done on the system’s silencing power. We first located the integration sites of the HLPs within the prototype’s genomes. Then, we analysed the silencing range of the HLPs and observed their effects on the genomic regions nearby by looking at the H3K9me3 epigenetic modification. Moreover, we analysed the expression patterns of the genes on and near the HLP. After a series of ChIP and qPCR experiments, we were able to understand the system’s capacity of silencing and so the ability of the prototypes. In the end, we concluded that one working haploid prototype was successfully produced and the silencing range of this prototype was very promising in the sense of leading the way for advanced haploid prototypes.
Later, in order to establish more controllable and secure silencing machinery, we upgraded the way of integrating dCas9-KRAB-MeCP2 transgene by generating a vector with a chemically inducible feature and a different integration method. Succeeding this, the next goal was to establish the advanced haploid mESC prototype. Unfortunately, due to some experimental issues on cells ploidy, our attempt was failed. However, for future attempts, we were able to develop and produce the genetic components that are needed for the silencing machinery.
In conclusion, even though we still have some way to go until we produce the advanced haploid mESC prototype, throughout the project, we were able to bring an understating of how to establish the silencing machinery in the test prototypes and show the power of the silencing mechanism within.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
dCas9 KRAB MeCP2 gRNA HPL mESC H3K9me3 PCR ChIP
Schlagwörter
(Deutsch)
dCas9 KRAB MeCP2 gRNA HPL mESC H3K9me3 PCR ChIP
Autor*innen
Kemal Can Arat
Haupttitel (Englisch)
Establishment of an enhanced CRISPR repressor platform in haploid mouse embryonic stem cells
Paralleltitel (Deutsch)
Etablierung einer verbesserten CRISPR-Repressorplattform in haploiden embryonalen Mausstammzellen
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
108 Seiten
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Martin Leeb
AC Nummer
AC15680888
Utheses ID
56096
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |