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Silaffin-derived peptides generate silica structures for delivery and integral membrane protein encapsulation
Friedrich Bialas
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (Dissertationsgebiet: Chemie)
Betreuer*in
Christian F. W. Becker
DOI
10.25365/thesis.63272
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-24401.12281.256370-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Silica-Nanopartikel sind ungiftig und ihre Bioabbaubarkeit kann, abhängig von Morphologie und Porosität, eingestellt werden. Die biomimetische Synthese von Silica-Nanopartikeln wurde von den skelettbildenden Vorgängen in Schwämmen und Kieselalgen inspiriert und verläuft bei milden Reaktionsbedingungen und neutralem pH. Dabei werden bestimmte Polyamine und Peptide als Katalysator genutzt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde das Silica-präzipitierende R5-Peptid aus der Kieselalge C. fusiformis mit verschiedenen Lebensmittelinhaltsstoffen aus der Substanzklasse der Polyphenole, Galangin und Quercetin, verknüpft. Um dies zu ermöglichen mussten die Polyphenole zunächst mit einem geeigneten Linker modifiziert werden, welcher an der 7-O-Position der Moleküle angebracht wurde. Die Modifikation konnte bei Galangin in einer einstufigen Reaktion durchgeführt werden; bei Quercetin kam eine vierstufige Synthesestrategie zum Einsatz. Mit einer bereits etablierten Methode, die auch bei unmodifiziertem R5-Peptid angewendet wird, wurden kugelförmige Silicapartikel mit beiden Konjugaten hergestellt. Für die (konfokale) Fluoreszenzmikroskopie wurden die mit Galangin-R5 hergestellten Partikel mit einem Silanderivat des Fluoreszeins gelabelt; die Quercetin-R5-Silicapartikel konnten durch die intrinsische Fluoreszenz des Quercetinchromophors beobachtet werden. Die so durchgeführten Fluoreszenz-mikroskopieexperimente haben gezeigt, dass die Quercetin-R5-Silicapartikel, nicht aber die Galangin-R5-Silicapartikel innerhalb von drei Stunden mit hoher Effizienz in den Zellkern von humanen HT-29 Kolon-Tumorzellen aufgenommen werden. Die Aufnahme konnte als aktiver Endozytoseprozess, unabhängig von Mikropinozytose, identifiziert werden. Bei der angewendeten Konzentration von 70 µM wurden keine Toxizitäts-Effekte beobachtet. Ungiftige Silicapartikel dienen nicht nur zur Verkapselung von kleinen Molekülen, sondern können auch vollständige Proteine und Membranstrukturen enthalten.
Integrale Membranproteine sind in der Natur allgegenwärtig und bilden einen Großteil der Targetproteine für Arzneimittelwirkstoffe. Um sie zu erforschen, müssen sie in Lösung stabilisiert werden, was Detergenzien oder lösliche Fusionsproteine erfordert. Nanodiscs sind Membranlipidbizellen, welche durch das Membrane Scaffold Protein (MSP) in Form gehalten werden und wurden entwickelt, um solch eine Stabilisierung in einem festgelegten Membranumfeld zu gewährleisten. Bei der hier vorgestellten Arbeit wurden neue Varianten des MSP entworfen, bei denen das R5-Peptid genetisch an den N- und/oder C-Terminus des Proteins geknüpft wurde. Dadurch konnten Plasmide für drei neue Konstrukte, R5-MSP, MSP-R5 und R5-MSP-R5, erhalten werden, inklusive eines entfernbaren His-Tags für die Proteinaufreinigung. Das R5-MSP-R5-Konstrukt konnte erfolgreich exprimiert und aufgereinigt werden. Ebenso wie beim ursprünglichen MSP konnten mit dem R5-MSP-R5-Protein Nanodiscs mit dem Phospholipid DOPC hergestellt werden, welche mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und dynamischer Lichtstreuung (DLS) charakterisiert wurden. Wie erwartet, konnten die modifizierten R5-MSP-R5 Nanodiscs, nicht aber die MSP Nanodiscs die Bildung von Silicapartikeln induzieren, welche mittels TEM und Rasterkraftmikroskopie (AFM) untersucht wurden. Beide Untersuchungsmethoden zeigen fibrillenartige Strukturen, welche silicabeschichteten Stapeln von Nanodiscs entsprechen. Diese stellen ein völlig neuartiges Material dar, welches sich je nach eingebetteten Molekülen mit Eigenschaften ausstatten lässt. Der Versuch, E. coli Diacylglycerolkinase (DGK) in die Nanodiscs einzubetten gelang nicht, weshalb eine andere Strategie entwickelt wurde um Silica-verkapselte DGK zu erzeugen.
Um Membranproteine direkt in Lösung zu stabilisieren, wurde das amphiphile BP-1-Peptid entwickelt. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurden vier verschiedene auf BP-1 basierende Peptide entworfen, synthetisiert und aufgereinigt. Wie erwartet zeigen nur die modifizierten Varianten Silicapartikel-bildende Aktivität, wodurch Partikel unterschiedlicher Morphologie erhalten wurden. Ein stabilisierender Effekt auf das Membranprotein Diacylglycerolkinase durch die Peptide selbst konnte nicht gezeigt werden. Dennoch war es möglich, mit dem BP-1-R5 Peptid DGK in kugelförmige Silicapartikel zu verpacken. Dabei war das BP-1-R5-Peptid effektiver als das R5-Peptid. Die verkapselte DGK zeigte eine beeinträchtigte Kinaseaktivität gegenüber dem Substrat Dioleylglycerin, was durch limitierte Diffusion in die Partikel erklärbar ist. Die verkapselte Kinase war jedoch stabiler gegenüber Pronase E, künstlichem Magensaft (SGF) und gegenüber künstlichem Darmmedium (SIF). Somit konnte das BP-1-R5-Peptid als neues Werkzeug zur Verkapselung von Membranproteinen in Silicapartikeln genutzt werden. Solche funktionalisierten Partikel könnten in Sensoren oder Bioreaktoren genutzt werden.
Abstract
(Englisch)
Silica nanoparticles are non-toxic and of tuneable biodegradability depending on their morphology and porosity. The biomimetic synthesis of silica nanoparticles is inspired by the shell-forming processes of organisms such as sponges and diatoms and proceeds under mild conditions and at neutral pH. Suitable catalysts are certain polyamines and peptides. In the first part of this work, the silica-precipitating R5 peptide from the diatom C. fusiformis was conjugated with two different polyphenols, galangin and quercetin, as model natural compounds. This required the introduction of a suitably functionalized linker, which was placed at the 7-O position of galangin and quercetin. Galangin was modified with a carboxylic acid linker in a one-step reaction; a four-step synthetic strategy was used to introduce a similar carboxylic acid linker on quercetin. Spherical silica particles were precipitated from both conjugates using a previously established protocol for unmodified R5 peptide. To observe the particles by (confocal) fluorescence microscopy, galangin-R5 silica particles were labelled with a fluorescein-derived silane compound, whereas quercetin-R5 particles were monitored based on the intrinsic quercetin fluorescence. Confocal fluorescence microscopy experiments with HT-29 human colorectal cancer cells showed that the quercetin-R5 silica particles, but not the galangin-R5 silica particles are efficiently taken up into the cells and localize in their nuclei within 3 hours of exposure. The uptake mechanism was shown to be an active, energy-dependent process different from micropinocytosis. At the investigated concentration of 70 µM conjugate, no toxic effects were observed. Non-toxic silica particles not only offer the possibility to encapsulate small molecules, but also entire proteins and membrane structures.
Integral membrane proteins are ubiquitous in nature and present an important class of drug targets. Their investigation is complicated by the difficulty to stabilize them in solution, requiring the use of detergents or solubility tags. Nanodiscs, membrane lipid bicelles surrounded by the membrane scaffold protein (MSP), were developed to enable such stabilization in a defined membrane environment. In the work presented here, new variants of MSP were designed by genetically fusing the silica-precipitating R5 peptide to its N- and/or C-terminus. In this way, plasmids for the expression of three new variants, R5-MSP, MSP-R5, and R5-MSP-R5 were obtained, including a removable His6-tag for purification. The R5-MSP-R5 construct could be successfully expressed and purified. Analogous to the unmodified MSP, the R5-MSP-R5 protein could be used for the formation of nanodiscs with the membrane phospholipid DOPC, which were characterized by transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS). As expected, the R5-MSP-R5 nanodiscs, but not the MSP nanodiscs, induced silica particle formation in a solution of silicic acid. The particles were then characterized by TEM and atomic force microscopy (AFM). Both techniques revealed fibrous structures, corresponding to stacks of nanodiscs, which are covered by a layer of silica. This is a completely new material which might be equipped with various properties by embedding different molecules in the silica-covered nanodiscs. An attempt to embed the E. coli diacyl glycerol kinase (DGK) inside the nanodiscs did not succeed, therefore, a different strategy was devised to create silica-encapsulated DGK.
The amphiphilic BP-1 peptide was developed to stabilize membrane proteins in solution by direct interaction with the detergent-like amphiphilic peptide. In this work, four new peptide constructs, based on BP-1, were designed, synthesized and purified. As expected, the new variants, in contrast to the unmodified BP-1 peptide, induced the formation of silica particles of different morphologies from a solution of silicic acid. A stabilizing effect on the membrane protein diacylglycerol kinase (DGK) could not be observed when adding the peptides only. However, it was possible to encapsulate the DGK protein into spherical silica particles, when using the modified BP-1 constructs as catalysts. The BP-1-R5 peptide proved significantly more effective in this than the R5 peptide alone. The encapsulated DGK showed reduced kinase activity towards its hydrophobic substrate dioleylglycerol, most likely due to the limited diffusion of dioleylglycerol into the silica particles. However, DGK stability in BP-1-R5 silica particles was significantly increased as demonstrated in assays against Pronase E, simulated gastric fluid (SGF), and simulated intestinal fluid (SIF). Thus, BP-1-R5 proved to be a new tool to encapsulate functional membrane proteins in silica. These functionalised silica particles could be used to equip sensors or bioreactors.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Silica Silaffin Enzyme Nano particle Integral Membrane Protein Cellular Uptake Nucleus Enzyme Encapsulation Peptide Conjugate
Schlagwörter
(Deutsch)
Silica Silaffin Nanopartikel Enzym Membranprotein Wirkstofftransport Membrantransport Zellkern
Autor*innen
Friedrich Bialas
Haupttitel (Englisch)
Silaffin-derived peptides generate silica structures for delivery and integral membrane protein encapsulation
Paralleltitel (Deutsch)
Von Silaffinen abgeleitete Peptide erzeugen Silica-Strukturen für Delivery-Anwendungen und zur Verkapselung von Membranproteinen
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
148 Seiten
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Erik Reimhult ,
Freddy Kleitz
AC Nummer
AC16149709
Utheses ID
56122
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |