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Biochemical and structural characterization of the LUBAC and IKK complexes
Alan De Jesus Rodriguez Carvajal
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Fumiyo Ikeda
DOI
10.25365/thesis.73874
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-28221.72103.336066-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Ubiquitin ist sowohl ein kleines Peptid als auch eine PTM, welche an der Regulierung der meisten zellbiologischen Prozesse beteiligt ist. Dies beinhaltet oft die Polymerisation von Ubiquitin zu Ubiquitinketten. Met1-gebundene Ubiquitinketten, die durch den LUBAC-Komplex zusammengebaut werden, sind wichtige Regulatoren bei der Aktivierung der NF-κB Transkriptionsfaktoren. Dies wird durch die Aktivierung des IKK-Komplexes in einem Prozess erreicht, an dem LUBAC- und Met1-gebundene Ubiquitinketten beteiligt sind. Die LUBAC-IKK-Achse verbindet Signale von mehreren Stimuli mit der NF-κB-Aktivierung. Die beiden Komplexe sind daher wesentliche Komponenten der zellulären Signalgebung. Trotz ihrer zentralen Bedeutung für die NF-κB-Aktivierung ist noch vieles über LUBAC und IKK unbekannt. Met1-verknüpfte Ubiquitinketten sind wesentlich für die IKK-Aktivierung in einem Prozess, der die regulatorischen Untereinheit NEMO beinhaltet. Der Mechanismus, durch den NEMO die Aktivierung des Komplexes steuert, ist jedoch nicht bekannt. Um dieser Frage nachzugehen, versuchten wir zunächst rekombinante Met1-verknüpfte Ubiquitinketten mit Hilfe einer bioorthogonalen Ligationsreaktion stellenspezifisch an NEMO zu konjugieren; konnten das ubiquitinierte Protein jedoch nicht für die biochemische Analyse isolieren. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, die strukturellen und funktionellen Merkmale des LUBAC-Komplexes zu analysieren. LUBAC enthält zwei Ubiquitin-Ligasen: HOIP und HOIL-1L. HOIP ist für die Met1-verknüpfte Kettenmontage verantwortlich, die katalytische Funktion von HOIL-1L in dem Komplex ist jedoch unbekannt. Darüber hinaus gibt es nur begrenzte Strukturdaten für das LUBAC-Holoenzym. Wir entwickelten daher eine Methode zur Isolierung von hochwertigem, rekombinantem LUBAC, welches wir für die physikalische und biochemische Charakterisierung des Komplexes verwenden konnten. Wir zeigen, dass die Bestandteile von LUBAC eine äquimolare Stöchiometrie besitzen, und dass LUBAC in monomeren oder dimeren Zuständen existieren kann. Darüber hinaus bildet der Komplex eine längliche Struktur mit einem einzigen katalytischen Zentrum, das die katalytischen Domänen der beiden Ligasen und die Met1-bindende NZF-Domäne von HOIL-1L beinhaltet. Mittels eines konzertierten katalytischen Mechanismus, welcher HOIP und HOIL-1L beinhaltet, charakterisierten wir auch die Assemblierung von heterotypischen, Ester- und Met1-Bindungen enthaltenden Ubiquitinketten durch den Komplex. Darüber hinaus zeigen wir, dass die NZF-Domäne von HOIL-1L eine Komponente des heterotypischen Kettenaufbaus ist und schlagen einen Cys-Übertragungsmechanismus zwischen den beiden Ligasen vor. Zusammenfassend haben wir neue Strukturdaten des LUBAC-Holoenzyms erhalten und zeigen die Funktion von HOIL-1L während des heterotypischen Ubiquitin-Kettenaufbaus durch den LUBAC-Komplex.
Abstract
(Englisch)
Ubiquitin is a small peptide PTM involved in regulating most aspects of cell biology, which often involves its polymerization into ubiquitin chains. Met1-linked ubiquitin chains assembled by the LUBAC complex are critical regulators in activation of the NF-κB transcription factors. This is brought about through activation of the IKK complex in a process involving LUBAC and Met1-linked ubiquitin chains. The LUBAC-IKK axis connects signals from multiple stimuli to NF-κB activation, thus making the two complexes critical components in cellular signalling. However, despite their central importance in NF-κB activation, there is still much that is unknown about them. Met1-linked ubiquitin chains are essential for IKK activation in a process that involves its regulatory subunit NEMO. However, the mechanism through which NEMO drives activation of the complex is not known. We first attempted to address this issue using a bioorthogonal ligation reaction to conjugate recombinant Met1-linked ubiquitin chains to NEMO in a site-specific manner; however we could not isolate the ubiquitinated protein for biochemical analysis. The second aim of this thesis was to dissect architectural and functional features of the LUBAC complex. LUBAC contains two ubiquitin ligases: HOIP and HOIL-1L. HOIP is responsible for Met1-linked chain assembly, however the catalytic function of HOIL-1L in the complex is unknown. In addition, there is limited structural data available for the LUBAC holoenzyme. To address these issues we established means to isolate high-quality recombinant LUBAC, which we could use for physical and biochemical characterization of the complex. We show that LUBAC has equimolar stoichiometry between its constituents and can exist in monomeric or dimeric states. Moreover, the complex forms an elongated structure with a single catalytic centre comprising the catalytic domains of the two ligases and the Met1-binidng NZF domain of HOIL-1L. We also characterized the assembly of heterotypic ubiquitin chains containing ester-linked and Met1 bonds by the complex through a concerted catalytic mechanism involving HOIP and HOIL-1L. Furthermore, we show that the NZF domain of HOIL-1L is a component of heterotypic chain assembly and propose a Cys relay mechanism between the two ligases. In summary, we obtained novel structural data of the LUBAC holoenzyme and demonstrate the function of HOIL-1L during heterotypic ubiquitin chain assembly by the LUBAC complex.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
HOIP HOIL-1L SHARPIN LUBAC ubiquitin oxyester IKK NEMO CuAAC
Schlagwörter
(Deutsch)
HOIP HOIL-1L SHARPIN LUBAC ubiquitin oxyester IKK NEMO CuAAC
Autor*innen
Alan De Jesus Rodriguez Carvajal
Haupttitel (Englisch)
Biochemical and structural characterization of the LUBAC and IKK complexes
Paralleltitel (Deutsch)
Biochemische und strukturelle Charakterisierung der LUBAC- und IKK-Komplexe
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
191 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Katrin Rittinger ,
Andreas Bachmair
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC15692968
Utheses ID
56283
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 490 |