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Investigating a model cell line for tumour stem cells in colorectal cancer
Inga Koneczny
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Brigitte Marian
DOI
10.25365/thesis.6275
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30139.41844.841562-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Laut der Tumorstammzelltheorie ist nur ein Bruchteil der Zellen eines Tumors verantwortlich für Tumorbildung, -erhalt und -wachstum. Die Tumorstammzellen besitzen Eigenschaften von Stammzellen wie Langlebigkeit, Selbsterneuerung, ein hohes Differenzierungspotential, Schutz vor Apoptose und sie sind resistent gegenüber herkömmlichen Therapieansätzen. Im Darmkrebs kann man sich das so vorstellen, dass die initiale Mutation im APC-Gen, welche in den meisten Fällen beobachtet werden kann, zu einem konstitutiv aktiven Wnt Signaltransduktionsweg führt. Diese Signalkaskade ist auch in normalen adulten Stammzellen, die für den hohen Zellumsatz in der Darmschleimhaut verantwortlich sind, aktiv. Vorangegangene Studien zeigten, dass adenome Darmkrebszellen der Zellinie LT97 eine Unterpopulation besitzen, welche das Wnt- Zielprotein CD44 exprimieren und Stammzelleigenschaften zeigten, sowohl in der Genexpression (musashi, Telomerase), als auch in Kultur (erhöhte Wachstums- und Überlebensfähigkeit verglichen mit den CD44- Zellen). In der vorliegenden Diplomarbeit wurden die grundlegenden Mechanismen, die zu der verstärkten Wachstums- und Überlebensfähigkeit der CD44+ Population führen, auf RNA-Ebene mittels Standard- und RealTime PCR, und auf Protein-Ebene mittels Western blot untersucht. Das Ergebnis zeigt (1) Schutz vor Apoptose durch Expression des Wnt-Zielgens survivin in CD44+ Zellen, (2) Herunterregulierung des IGF1 Überlebenssignals durch IGFBP3 Expression in CD44- Zellen, und (3) Hochregulierung der FGFR3IIIc Splice Variante in CD44+ Zellen, welche ein FGF18 abhängiges Überlebenssignal andeuten. Analyse des downstream signalling durch Western blot zeigte reduzierte Phosphorylierung von IRS1, GSK3, ERK1/2 und S6 und verringerte Expression von IRS1, GSK3 und S6 in CD44- Zellen. Sowohl Hemmung des Wnt Signalwegs mit Sulindac als auch des IGF Signalwegs mit PPP führten zu verringertem Wachstum und Überleben von CD44+ Zellen, was die Bedeutung dieser Signalwege für die Ausbildung von Darmtumoren aufzeigt. Expression eines dominant negativen FGFR3 Konstrukts erhöhte die Effizienz des Ausplattierens, aber führte zu verringertem Wachstum in CD44+ und CD44- Zellen, während die Einführung eines FGF18 überexprimierenden Konstrukts zu erhöhtem Wachstum und Überleben in CD44+ Zellen führte. In einer vergleichenden Studie von Kandidaten für Stammzellmarker wurde eine umgekehrte Beziehung zwischen CD44 und CD133 sowie eine direkte Beziehung zwischen CD44 und CD166 sowohl in Zellinien als auch Primärkulturen von kolorektalen Tumoren entdeckt. Musashi und Lgr5 wurden hauptsächlich in Normalgewebe und kaum in Tumorgewebe gefunden. Zusammenfassend kann man sagen, dass drei für verstärktes Wachstum und Überleben von CD44+ Zellen verantwortliche und somit für therapeutische Ansätze vielversprechende Signalwege bestätigt wurden, wohingegen der Stammzell-Zustand der CD44+ LT97 Zellen nicht verifiziert werden konnte.
Abstract
(Englisch)
According to the cancer stem cell theory, only a small subset of cells in a tumour is responsible for tumour initiation, maintenance and growth. The cancer stem cells (CSC) display stem cell characteristics like longevity, self-renewal, a high differentiation potential and protection from apoptosis and are resistant to conventional therapy approaches. For colon cancer this phenomenon can easily be envisioned as the initial APC-mutation observed in most colon cancers leads to a constitutively active Wnt pathway. This signalling cascade is also active in the normal adult stem cells that drive cell turn over in the colonic mucosa and are situated at the bottom of the colonic crypt. Previous studies revealed a subpopulation in LT97 colon adenoma cells positive for the Wnt target protein CD44 that also displayed stem cell characteristics in gene expression (musashi, telomerase) and behaviour (enhanced growth and survival abilities compared to CD44- cells). In the present thesis the underlying mechanisms that lead to enhanced growth and survival of the CD44+ subpopulation were investigated on RNA level by standard and RealTime PCR and on protein level by western blot. The results indicate (1) protection from apoptosis by expression of the Wnt target gene survivin in the CD44+ cells; (2) down modulation of IGF1 survival signalling by IGFBP3 expression in CD44- cells. and (3) up regulation of the FGFR3IIIc splice variant CD44+ cells indicating a FGF18 dependent survival signal. Analysis of downstream signalling by western blot revealed reduced phosphorylation of IRS1, GSK3, ERK1/2 and S6 and decreased protein expression of IRS1, GSK and S6 in CD44- cells. Both inhibition of Wnt signalling by Sulindac and IGF signalling by PPP led to decreased growth and survival of CD44+ cells, indicating the importance of these pathways for colon tumour formation. Expression of a dominant negative FGFR3 construct increased plating efficiency, but led to decreased growth of CD44+ and CD44- cells, while introduction of a FGF18 over expressing construct led to enhanced growth and survival in CD44+ cells. In a comparative study of candidate stem cell markers a reverse relationship between CD44 and CD133 as well as a direct relationship between CD44 and CD166 was found in both cell lines and primary cultures obtained from colorectal tumours. Musashi and Lgr5 were found more in normal tissue than in tumour sections. In summary, 3 signalling pathways responsible for enhanced growth and survival of CD44+ LT97 cells and promising for therapeutic targeting have been verified; however the stem cell state of CD44+ LT97 has not been appraised.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Tumour stem cells tumor stem cells colon cancer LT97 CD44 IGF1 FGFR3 Wnt primary culture spheroblast spheroid
Schlagwörter
(Deutsch)
Tumorstammzellen Darmkrebs LT97 CD44 IGF1 FGFR3 Wnt Primärkultur Spheroblast spheroid
Autor*innen
Inga Koneczny
Haupttitel (Englisch)
Investigating a model cell line for tumour stem cells in colorectal cancer
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchung einer Modellzellinie für Tumorstammzellen in kolorektalem Krebs
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
133 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Brigitte Marian
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.81 Onkologie
AC Nummer
AC08159714
Utheses ID
5644
Studienkennzahl
UA | 490 | | |