Detailansicht
Colon cancer spheroids and fluorescence microscopy for visualizing microbe-tumour interaction
Adrijana Sarenac
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Manfred Ogris
Mitbetreuer*in
Haider Sami
DOI
10.25365/thesis.63677
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-26862.47348.748160-1
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Krebs kann aus fast jedem Gewebe im Körper entstehen, in dem Zellen unkontrolliert
zu wachsen beginnen und eine Masse bilden, die als Tumor bezeichnet wird. Die
wichtigste Behandlung ist nach wie vor die Chemotherapie, die sich schnell teilende
Krebszellen zerstört, aber auch normale Zellen im Körper betrifft.
Um die Schädigung gesunder Zellen und viele Nebenwirkungen zu verringern, hat die
Medizin in den letzten Jahren erstaunliche Fortschritte gemacht und neue Verfahren
und Behandlungen eingeführt, die die Lebenserwartung der von Krebs Betroffenen
erhöhen. Eine der beeindruckendsten Behandlungen ist die Kombination eines
immunogenen Chemotherapeutikums mit leeren Bakterienhüllen (‚Bacterial Ghosts‘,
BGs) als Adjuvans.
Diese Arbeit erklärt die Verfolgung und Visualisierung der Wechselwirkung von
Mikroben und Tumoren aufgeteilt in zwei verschiedenen Projekten. Es konzentriert
sich auf leere Zellhüllen von gramnegativen Bakterien und anaerobe, nicht pathogene
Mikroben, Archaeen.
In dem Projekt zur biologischen Verteilung von BGs wurde Alexa Fluor-750 als
Fluorophor zur Markierung der BGs verwendet. Dessen Anregungs- und
Emissionsmaxima im nahen Infrarotbereich (NIR) ermöglichen die Signaldetektion
auch in tiefer liegenden Gewebeschichten. Die Bioverteilung von BGs wurde 2 Stunden
nach der Verabreicherung in Geweben von tumorfreien Mäusen und 24 Stunden nach
der Verabreichung in CT26-tumortragenden Mäusen verfolgt. Die Experimente
umfassten die Untersuchung von Gefrierschnitten aller Organe und deren Bildgebung
mit Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie, um das Vorhandensein oder Fehlen eines
AF750-Signals von BGs festzustellen.
11
Bei nicht tumortragenden Mäusen nach zweistündiger Bioverteilung konnte gezeigt
werden, dass die AF750-markierten BGs hauptsächlich im Magen-Darm-Trakt, in der
Bauchspeicheldrüse und im Uterus nachgewiesen wurden. Dieses Experiment wurde
noch ohne Gewebe aus unbehandelten Kontrollmäusen durchgeführt. Die Ergebnisse
sollen jedoch in weiteren Experimente zu deren Vervollständigung verwendet werden.
Die AF750-markierten BGs in den tumortragenden Tieren nach 24-Stunden
Bioverteilung wurden hauptsächlich im Magen-Darm-Trakt nachgewiesen, aber auch
im Pankreasbereich und im Peritoneum lokalisierter Tumorläsionen zeigten das
Vorhandensein von BGs.
Die Bildgebung konzentrierte sich auf die Verkürzung der Belichtungszeit, um
Autofluoreszenz zu vermeiden.
Um die NIR-Bildgebung von AF750-BGs zu optimieren, wurden mit BG dotierte
Gewebeschnitte zur Optimierung der Belichtungszeit zur Vermeidung von
Autofluoreszenz verwendet. Organe von mit BGs behandelten Mäusen wurden mit
Organen von nicht behandelten Kontrollmäusen verglichen, was reproduzierbare
Daten und eine Sicherheit in Bezug auf Signaldetektion liefert.
Archaea wurden mit Invitrogen Alexa Fluor-488 kovalent markiert, einem grünen
Fluoreszenzfarbstoff mit einem Anregungsmaximum bei 488nm. Aufgrund seiner
hohen Fluoreszenzintensität ermöglicht dieser Farbstoff den Nachweis auch von
Signalen mit geringer Häufigkeit. Das Experiment wurde durchgeführt, um die Archaea
24h, 120h und 168h nach Inokulation mit mehrzelligen CT-26 3D-Tumorsphäroiden
generier mit 5000 und 10000 Zellen zu verfolgen. Darmkrebszellen bilden in sieben
Tagen ein stabiles Sphäroid mit runder Ausformung. Durch Ernten und Einbetten zu
drei verschiedenen Zeitpunkten konnte die Lokalisation von Archaea zu allen
untersuchten Zeitpunkten bestimmt werden.
Das Vorhandensein von Archaea war zu jedem Zeitpunkt deutlich sichtbar, nicht nur
an der Oberfläche, sondern auch innerhalb des Sphäroids.
Abstract
(Englisch)
Cancer can arise from almost any tissue in the body, where cells start to grow
uncontrollablyforming a mass called a tumour. The most important treatment is still
chemotherapy, which destroys rapidly dividing cancer cells but affects also normal
cells in the body. To reduce damage of healthy cells and a lot of side effects, medicine
has made stunning advances in recent years, establishing new procedures and
treatments that increase the life expectancy of those affected by cancer. One of the
promising treatments is combination of immunogenic chemotherapeutic agent with
bacterial ghost as an adjuvant.
This thesis explores tracking and visualizing of microbe-tumour interaction within two
different research projects. The microbe employed in the present work include a)
empty cell envelopes of Gram-negative bacteria called bacterial ghost (BG) and b)
anaerobic, nonpathogenic microbe, archaea.
In the bacterial ghost biodistribution project, Alexa Fluor-750 was used as a
fluorophore for labeling of BGs. It’s excitation and emission maxima in the near
infrared (NIR) range allows signal detection in deeper lying signals. Biodistribution of
BGs was tracked 2hrs after administration in tissues from tumour-free mice and 24hr
after administration in CT26-tumour bearing mice. Experiments included
cryosectioning of all the organs and imaging with widefield epifluorescence microscopy
to look for presence or absence of AF750 signal from BG. In the non-tumour bearing
mice with two hours biodistribution, it could be shown, that the AF750 labelled
bacterial ghosts were mainly detected in the gastrointestinal tract, pancreas and
uterus. In this experiment control mice were not used for comparison with treated
mice and thereby the results will be used if further experiments for completion.The
AF750 labelled bacterial ghosts in the tumour-bearing 24 hours biodistribution mice
were mainly detected in the gastrointestinal tract, but also tumour lesions localized in
9
the pancreatic area and the peritoneum showed presence of BGs. Imaging was
focused on lowering exposure time in order to avoid autofluorescence.
To optimize NIR Imaging of AF750-BGs, BG spiked tissue sections were used for
optimizing exposure times for avoiding autofluorescence. Organs from BG treated
mice were compared with organs from non-treated control mice which provides
reproducible data and certainty of signal existence.
Archaea were labelled with Alexa Fluor-488, a green fluorescent dye with an excitation
maximum at 488 nm. Due to its high fluorescent intensity, this dye allows detection
also of low-abundant signals. Experiment were conducted to track the Archaea 24h,
120h and 168h after inoculation with CT26 3D multicellular tumour spheroids
containing 5 000 and 10 000 cells. Colon cancer cells are forming a stable spheroid
seven days long in order to make a perfect round form. Harvesting and embedding at
three different time points allow us to confirm the existence of Archaea also after
certain time.Presence of Archaea was clearly visible at any time point, not just on the
surface but also inside the spheroid.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
BGs for gene delivery BGs as adjuvant immunostimulant 3D spheroid based tumor models Archaea as adjuvant immunostimulant
Schlagwörter
(Deutsch)
BGs für die Genabgabe BGs als adjuvantes Immunstimulans 3D-Tumormodelle auf Sphäroidbasis Archaea als adjuvantes Immunstimulans
Autor*innen
Adrijana Sarenac
Haupttitel (Englisch)
Colon cancer spheroids and fluorescence microscopy for visualizing microbe-tumour interaction
Paralleltitel (Deutsch)
Darmkrebs-Sphäroide und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der Wechselwirkung zwischen Mikroben und Tumoren
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
95 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Manfred Ogris
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC16152801
Utheses ID
56491
Studienkennzahl
UA | 449 | | |