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Microscopy based methods for studying tumor-microbe interaction in murine colon cancer allograft tissue and spheroids
Hanan Raheb
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Manfred Ogris
Mitbetreuer*in
Haider Sami
DOI
10.25365/thesis.63769
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-26864.09723.929165-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Diese Arbeit basiert auf dem Einsatz der Fluoreszenzmikroskopie (FLM) zur Untersuchung
der Verteilung fluoreszenzmarkierter Mikroben in Darmkrebsmodellen auf der Basis der
murinen Tumorzelllinie CT26. Das erste Projekt untersucht die Bioverteilung von leeren
Bakterienhüllen (Bacterial Ghosts, BGs) in CT26-tumortragenden Mäusen, während das
zweite Projekt die Infiltration von Archaeen in aus CT26 Zellen gebildeten mehrzelligen
Tumorsphäroiden (MCTS) untersucht. Sowohl von den Organen der CT26-tumortragenden
Mäuse als auch von den CT26-Sphäroiden wurden Gefrierschnitte angefertigt und die
entsprechenden Fluoreszenzsignale abgebildet.
Der erste Teil dieser Arbeit stellt das Projekt der BGs vor, bei dem diese mit dem Nahe-infrarot
Fluoreszenzfarbstoff AF750 kovalent markiert sind und durch Fluoreszenzemission im nahen
Infrarotbereich sowie durch Immunfärbung gegen das Eisnukleationsprotein (INP)
nachgewiesen wurden. Von den Organen, die den CT26-tumortragenden Mäusen (2 Stunden
nach Injektion von AF750-BGs) entnommen wurden, wurde der Pankreas und im CT26
Tumorlesionen im Pankreas ausgewählt und davon Gefrierschnitte angefertigt. Diese wurden
dann einer FLM unterzogen, um a) die BGs über die AF750-Emission (Cy7-Kanal) und über
das INP (FITC-Kanal, nach Immunfluoreszenzfärbung mit den Fluoreszenzfarbstoff AF488)
nachzuweisen und b) die Tumorzellen über DAPI-Emission nachzuweisen. Die Assoziation
der BGs mit den Tumorzellen wurde anhand von drei Bildgebungszielen untersucht und
dargestellt: 1. Überlappung der AF750- und AF488-Emission bei unterschiedlichen
Vergrößerungen, 2. Möglichkeit der Betrachtung der AF750-BGs durch den Cy7-Filter bei 10-
facher Vergrößerung und einer Belichtungszeit zwischen 1,5 und 2 Sekunden und 3. Abbildung
der intakten BGs bei 60-facher Vergrößerung.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden auf ähnliche Weise fluoreszenzmikroskopische Techniken
eingesetzt, um die Infiltration von Archaeen in 3D-MCTS auf CT26-Basis zu beobachten.
Diese Sphäroide wurden mit nicht pathogenen, streng anaeroben Archaea des Stammes
Methanococcus maripaludis S0001 beimpft. Die Lokalisation der Archaea wurde zu drei
Zeitpunkten (24, 120 und 168 Stunden) verfolgt, um zu beobachten, ob die Archaea in die
Tumorsphäroide eindringen können. Die Fluoreszenzbilder der DAPI-gefärbten
Gefrierschnitte der Sphäroide veranschaulichen die Lokalisierung der AF488-markierten
Archaeen auf der Oberfläche von Sphäroiden, die 24 Stunden lang mit Archaeen kultiviert
wurden, und die Tendenz dieser Mikrobe, sich nach 120-stündiger Kultivierung in Richtung
Zentrum des Sphäroids zu bewegen. Schließlich erbrachten die überlagerten Messkanäle DAPI
und FITC der Gefrierschnitte der Sphäroide, die 168 Stunden lang mit AF488-markierten
Archaeen kultiviert worden waren, den Nachweis für die Lokalisierung anaerober Archaeen
nahe und innerhalb der hypoxischen Bereiche dieser Sphäroide, was wiederum die Selektivität
dieser Mikroorganismen voraussagt auch in vivo auf die hypoxischen Zentren von
Krebsgewebe abzuzielen.
Abstract
(Englisch)
This work is based on employing fluorescence microscopy (FLM) for studying the distribution
of fluorescently labeled microbes within colorectal cancer models based on the murine cell line
CT26.The first project investigates the biodistribution of bacterial ghosts (BGs) in CT26 tumor
bearing mice, while the second one studies the infiltration of archaea within CT26 derived
multicellular tumor spheroids (MCTS). Both, organs from CT26 tumor bearing mice and
spheroids derived from CT26 cells, were cryo-sectioned and imaged for the desired
fluorescence.
The first part of this thesis presents bacterial ghosts’ project, where BGs were labeled with
AF750 dye and detected by near infrared fluorescence emission and also by immunostaining
for ice nucleation protein (INP). Out of the organs harvested from CT26 tumor bearing mice
(2 hours after injecting AF750-BGs), pancreas and pancreatic tumor nodules were selected and
cryo-sectioned, and were then subjected to FLM for detecting a) BGs via direct AF750
emission (Cy7 channel) and via the presence of INP (FITC channel) and b) tumor cells via
DAPI emission. The association of BGs with tumor cells had been imaged and investigated
through three imaging aims: 1. Overlap between AF750 and INP emission at different
magnifications; 2. ability to observe the AF750-BGs through Cy7 filter at 10X magnification
and exposure time between 1.5-2 s; 3. imaging the intact BGs at 60X magnification.
Similarly, the second part of thesis employed fluorescence microscopy techniques to observe
archaea infiltration in CT26-based 3D MCTS. These spheroids were inoculated with the
nonpathogenic, strictly anaerobic archaea, Methanococcus maripaludis S0001, and the
localization of archaea was tracked at three timepoints after inoculation, i.e.; 24, 120 and 168
hours, in order to observe if they are able to infiltrate into the tumor spheroids. Fluorescent
imaging for the DAPI stained spheroids’ cryosections illustrated the localization of archaea
labeled with the dye AF488 (emission in the FITC channel) on the surface of spheroids
inoculated with archaea for 24h, and the tendency of this microbe to move toward the center
after 120 hours of inoculating the spheroids. Finally, DAPI and FITC merged channels for the
cryosections of spheroids inoculated with “AF488 labeled” archaea for 168 hours could proof
the localization of anaerobic archaea near and within the hypoxic areas of these spheroids,
which could predict in turn the selectivity of these microorganisms for in vivo targeting the
hypoxic centers of cancerous tissues.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Microscope BGs Archaea
Schlagwörter
(Deutsch)
Mikroskop BGs Archaea
Autor*innen
Hanan Raheb
Haupttitel (Englisch)
Microscopy based methods for studying tumor-microbe interaction in murine colon cancer allograft tissue and spheroids
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
VI, 104 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Manfred Ogris
Klassifikation
44 Medizin > 44.42 Pharmazeutische Chemie
AC Nummer
AC16152574
Utheses ID
56574
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |