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Differential cofactor dependencies define functionally distinct types of human enhancers
Christoph Neumayr
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Biologie)
Betreuer*in
Alexander Stark
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-22801.50315.768970-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Differenzielle Genregulation ist der zugrundeliegende Prozess der die Entwicklung eines multizellulären Organismus ermöglicht, bestehend aus unterschiedlichen Zelltypen die ver-schiedenen Funktionen ausführen können. Im Zentrum dieses Prozesses befinden sich Tran-skriptionsverstärker oder Enhancer Elemente. Enhancer werden von Transkriptionsfaktoren sowie Kofaktoren, welche aktivierende oder reprimierende Eigenschaften besitzen können gebunden. Die daraus resultierende Kombination aus Aktivierung und Reprimierung gene-riert einen bestimmten Aktivitätszustand eines Enhancers wodurch dieser eine Interaktion mit seinem Zielpromoter eingeht und dadurch eine Gentranskription einleitet. Genomewei-te Assoziationsstudien zeigen eine eindeutige Korrelation zwischen Enhancermutationen und der Entwicklung von Krankheiten, weshalb es wichtig ist Enhancer im menschlichen Genome zu lokalisieren. Einige spezielle Eigenschaften der DNS z.B. Histonemodifizierun-gen oder histonefreie Abschnitte können zur vorhersagen von Enhancern herangezogen werden. Jedoch sind diese Merkmale nicht akkurat und können keine Aussagen über die Funktionalität sowie Aktivität eines Enhancers generieren. Um Enhancer im gesamten hu-manen Genome zu identifizieren und deren Aktivierungspotential und Funktionalität nach-zuweisen, haben Kollegen und ich eine Plasmid basierende Methode “humanes STARR-seq” entwickelt, basierend auf ”Fruchtfliegen STARR-seq”. Beim transferieren dieser Methode in das humane System sind zwei grundlegende Probleme aufgetreten. 1) Humane Zellen lösen aufgrund der Transfektion von Plasmiden eine immunologische Reaktionsantwort aus, wodurch nur Interferon Enhancer aktiviert werden welche die Aktivität anderen Enhancer unterdrücken. Um dieses Problem zu lösen haben wir Kinasen-Inhibitoren verwendet wel-che die Weiterleitung der Interferon-Immunantwort blockierten. 2) Das Element “Ursprung der Replikation” welches auf allen Plasmiden kodiert ist um eine Replikation in Bakterien zu ermöglichen, kann die Funktion eines Promoters übernehmen. Dadurch entsteht eine Inter-ferenz mit dem auf dem Plasmid verwendeten Promoter welcher mit potentiellen Enhan-cer-Elementen interagieren sollte. Um diese kryptische Aktivierung und Interferenz zwi-schen dem Replikationselement und dem Plasmid-Promoter aufzuheben verwendeten wir nur noch das Replikationselement als einzigen Promoter. Im weiteren Verlauf meiner Dok-torarbeit wollte ich eine seit langem bestehende Frage im Arbeitsfeld der Transkriptions-kontrolle beantworten: Existieren im menschlichen Genome unterschiedliche Enhancer wel-che von verschiedenen Kofaktoren abhängig oder unabhängig sind? Diese Hypothese basiert auf Studien welche herausfanden das nach der Inhibierung oder Degradierung essentieller Kofaktoren nur zelltypspezifische Signalwege betroffen waren. Des Weiteren zeigten zu-sätzliche Daten, dass einige Signalkaskaden nur spezifische Kofaktoren rekrutierten sowie das bestimmte Transkriptionsfaktoren das Potential besitzen direkt Untereinheiten der Trankriptionsmaschinerie zu ihren Zielgenen zu rekrutieren. Um die erstellte Hypothese zu beantworten kombinierte ich eine Proteindegradierungsmethode mit humanen STARR-seq. Ich fand dabei heraus, dass der Großteil an aktiven Enhancern abhängig ist von fast allen Kofaktoren. Obwohl die Degradierung des Kofaktors Brd4 auch zu einem globalen Enhan-ceraktivitätsverlusts führte, kam es zu der Aktivierung einer bestimmten Klasse von viralen Elementen. Diese Elemente wiesen eine TATA und CCAAT-box auf, welche auch in den Promotern von Histone Genen vorhanden sind. Ich konnte nachweisen das diese Histone- sowie Hitzeschock Gene, welche nur eine TATA-box besitzen, auch ohne Brd4 aktiviert wer-den können. Abschließend fand ich heraus das nach fast kompletter Entfernung des Kofak-tors Mediator, P53 gebundene Enhancer sowie P53 Zielgene, welche in der Apoptose oder dem Zellzyklus involviert sind immer noch funktionsfähig waren. Diese Daten weisen auf einen verkürzten Aktivierungsweg von P53 Zielgenen hin welche die Funktionalität des Me-diator Komplexes nicht benötigt.
Abstract
(Englisch)
Transcriptional regulation is the underlying process that enables the development of multi-cellular organisms, comprising various cell types with different functions. In general, gene transcription is initiated via the binding of cell-type specific transcription factors (TFs) to enhancers. These TFs recruit cofactors (COFs), including co-activators and co-repressors. The combined binding of COFs to an enhancer enables an interaction with its target promoter and the activation of the target gene. This capability, to integrate in-tra/extracellular signals that control spatiotemporal expression of genes, positions enhanc-ers at the center of transcription regulation. Genome wide association studies (GWAS) have indicated the involvement of many non-coding regulatory regions within the develop-ment of diseases. Thus, the identification of enhancers on a genome wide scale within hu-man cells is of great importance. Predictive methods to identify enhancers utilize the occur-rence of histone modifications or open chromatin features, however these techniques lack the ability to assess actual enhancer function and activity. Therefore, together with col-leagues in the lab, we developed human STARR-seq, a massively parallel reporter plasmid-based assay (MPRA) that allows the identification and quantitative measurement of en-hancers throughout the human genome. The method STARR-seq was previously developed for use in D. melanogaster cells, therefore the challenge was to transfer it into human cells. The particular challenges to overcome were 1) prevent the induction of an interferon re-sponse due to plasmid transfection and 2) the ability of the origin of replication (ORI), en-coded within all commonly used plasmids to allow for plasmid replication, to function as a core promoter. To circumvent these issues we made use of kinase inhibitors, repressing the release of a type I interferon response, and utilized the ORI as the only core promoter to abolish cryptic transcription and promoter crosstalk. Using the now established human STARR-seq system, I investigate a longstanding question in the field of transcription: Do different types of enhancers exist, that depend on various cofactors? This question is based on studies utilizing COF inhibitors or COF depletion systems which observed selective ef-fects on genes associated with super-enhancers (SE) or cell type specific core regulatory circuits. Moreover, other studies indicated that certain regulatory pathways recruit specific COFs or COF subunits and suggest furthermore that TFs involved in stress responsive path-ways can even tether subdomains of the transcriptional machinery toward their target genes. These findings question if different groups of COF are involved or even dispensable in various regulatory pathways. To answer this hypothesis, I used an auxin inducible degra-dation system to deplete COFs involved in transcription in combination with STARR-seq to measure enhancer activities in the presence and absence of a COF. I found that the majority of endogenous active enhancers are dependent on almost all COFs. However, although the degradation of the bromodomain containing protein 4 (Brd4) led to a global loss of enhanc-er activity, a class of long terminal repeats (LTRs) was upregulated. A motif enrichment analysis within these LTRs revealed the motifs TATA and CCAAT box, additionally found in histone genes, which could also be activated in the absence of Brd4. Furthermore, TATA-box-only containing stress responsive heat shock genes were also Brd4 independent. Last, after the depletion of a Mediator subunit (Med14), STARR-seq and precision nuclear run on (PRO-seq) suggested that P53 bound enhancers and P53 target genes are insensitive to low levels of Mediator. As ChIP-seq against a Mediator subunit (Med1) indicated no binding of Mediator at p53 target genes at any time, my work suggests a shortcut mechanism for P53 mediated gene activation without the Mediator complex.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Genomics Transcription control Transcription regulation Epigenetics Proteomics STARR-seq
Schlagwörter
(Deutsch)
Genomik Transkriptionskontrolle STARR-seq
Autor*innen
Christoph Neumayr
Haupttitel (Englisch)
Differential cofactor dependencies define functionally distinct types of human enhancers
Paralleltitel (Deutsch)
Unterschiedliche Kofaktor-Abhängigkeiten definieren verschieden funktionelle Typen von humanen Enhancern
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
IX, 156 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Pavel Kovarik ,
Daniel Wolfram Gerlich
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie ,
42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Nummer
AC16057458
Utheses ID
57109
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 437 |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1