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Optimization of multi-reporter luciferase assays for simultaneous measurement of signaling pathway activities

Silvia Weiss

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Manfred Ogris

Mitbetreuer*in

Haider Sami

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DOI

10.25365/thesis.64709

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-19645.81110.677966-9

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Krebs entsteht nicht durch einzelne, sondern viel mehr durch eine Vielzahl an Mutationen oder fehlregulierten Signalwegen. Es resultiert ein komplexes biologisches System fehlregulierter Signalwege, eine Fehlfunktion des Immunsystems oder Mutationen verschiedener Gene daraus. Dadurch ist es umso wichtiger, dass Forschern nützliche Methoden zur Verfügung stehen, um zahlreiche Komponenten, welche mit Malignität in Verbindung stehen, gleichzeitig messen zu können. Signalwege wie Sonic Hedgehog, Notch und Wnt spielen vermutliche eine große Rolle bei der Krebsentwicklung und -progression. Des Weiteren wird angenommen, dass die Signalwege in Krebsstammzellen fehlreguliert und dadurch an der Therapieresistenz vieler verschiedener Krebsarten beteiligt sind. Daher ist es umso wichtiger, Wissen über die Aktivität der einzelnen Signalwege in unterschiedlichen Zelllinien, sowie ihr Zusammenspiel zu erlangen. Multiple Reporterplasmide können sehr hilfreiche Werkzeuge sein, um die Aktivität und das Zusammenwirken zu messen. Diese Arbeit konzentriert sich auf ein multiples Luciferase-Reporterplasmid (3P-Luc, basierend auf Firefly, NanoLuc und Gaussia Luciferase), wobei jeder Luciferase-Reporter von Komponenten eines spezifischen Signalweges kontrolliert wird, wodurch die Aktivität drei spezifischer Signalwege gleichzeitig gemessen werden kann, nämlich Sonic Hedgehog, Notch und Wnt. 3P-Luc Plasmid basierte Polyplexe wurden in mehreren Zelllinien für in-vitro Transfektionen verwendeten und die unterschiedlichen Messungen aus einem Well in einem Assay optimiert, genannt Multi-Luc/BSA Assay. Experimente wurden mit unterschiedlichen Zelllinien – HEK293T, MDA-MB-231 WT, MDA-MB-231 LM2-4, CT26 und LS174T – durchgeführt, wobei drei unterschiedliche Konzentrationen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gemessen wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die simultane Messung mittels Multi-Luc/BCA Assay präzise und zuverlässig in allen getesteten Zelllinien funktioniert. Unterschiede der Signalwegaktivitäten der einzelnen Zelllinien konnten durch die Normalisierung des Assays anhand der Transfektionseffizienz der Firefly Luciferase (durch Co-Transfektion mit LucSH-Plasmid) oder mittels Prozentsatz der EGFP positiven Zellen nach Transfektion mit 3P-Luc (unabhängig mit dem Durchflusszytometer gemessen) verglichen werden. Somit ist der optimierte Multi-Luc/BCA Assay hilfreich zur simultanen Bestimmung mehrerer Signalwegaktivitäten und das Zusammenspiel der einzelnen Signalwege unterschiedlicher Zelllinien kann zusätzlich untersucht werden.

Abstract

(Englisch)

Cancer often evolves nor from single, but rather from several mutations or dysregulated pathways. A complex biological system of dysfunctional pathways, malfunction of the immune system or mutations on different genes occur. Sometimes multiple causes go hand in hand. Thus, it is all the more important that scientist have useful tools to study multiple elements simultaneously which contribute to malignancy. Signaling pathways like Sonic Hedgehog, Notch and Wnt are all suspected to play a key role cancer development and progression. Moreover, it is assumed that those pathways are dysfunctional in cancer stem cells and thereby involved in therapy-resistance of many cancer types. Hence, gaining knowledge about the specific activity of each pathway in different cancer cell types, but also their interplay with each other is all the more important. Multi-reporter plasmids can be very useful tools to detect their activity and interplay in cancer cells. This thesis focuses on a multi-luciferase reporter plasmid (3P-Luc, based on Firefly, Nanoluc and Gaussia luciferase) where each luciferase reporter is under control of components for a specific signaling pathway and thus activity of three specific pathways can be analyzes simultaneously, namely Sonic Hedgehog, Notch and Wnt. 3P-Luc plasmid based polyplexes were used for in vitro transfection in a variety of cell lines and the read-out of different luciferases from the same well was optimized within one assay, namely Multi-Luc/BCA assay. Experiments were performed with different cell lines – HEK293T, MDA-MB-231 WT, MDA-MB-231 LM2-4, CT26 and LS174T – using three different concentrations, while measuring at two different time points. Results show that the simultaneous read-out of cells using Multi-Luc/BCA assay works precisely and reliable in all the cell lines tested. Pathway activity differences across cell lines were compared by normalizing the Multi-Luc/BCA read-out with either Firefly luciferase transfection efficiency (by co-transfection with LucSH plasmid) or percentage of EGFP positive cells after 3P-Luc transfection (separately measured by flow cytometry). Thus, the optimized Multi-Luc/BCA assay is quite useful for estimating multiple pathway activities simultaneously and the pathway-interplay of different cell lines can be investigated using this method.

Autor*innen

Silvia Weiss

Haupttitel (Englisch)

Optimization of multi-reporter luciferase assays for simultaneous measurement of signaling pathway activities

Paralleltitel (Deutsch)

Optimierung von Multi-Reporter Luciferase Assays zur simultanen Messung von Signalweg-Aktivitäten

Publikationsjahr

2020

Umfangsangabe

111 Seiten : Illustrationen

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Manfred Ogris

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften

AC Nummer

AC16201028

Utheses ID

57417

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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