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Development of a DNA-based multiplex assay to characterise pathogens and their antibiotic resistance and virulence factor genes

Noa Wolff

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (DissG: Biologie)

Betreuer*innen

Angela Witte ,

Andreas Weinhäusel

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DOI

10.25365/thesis.65107

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-21637.51801.521269-3

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen wird von der Europäischen Union (EU) und der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als eine der größten globalen Bedrohungen der Gesundheit angesehen1. Die größte Gefahr geht von multiresistenten Krankheitserregern aus, die gegen viele der häufig verwendeten Antibiotika resistent sind. Beispiele für diese sind Carbapenem-resistente und β‑Lactamase produzierende Enterobacteriaceae oder die sechs Krankenhauskeime, die unter dem Akronym ESKAPE zusammengefasst werden: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp. Solche multiresistenten Krankheitserreger stellen im klinischen Bereich eine große Gefahr dar, z. B. während chirurgischer Eingriffe, der Krebstherapie und insbesondere für immungeschwächte Patienten. Schätzungen zufolge werden 2050 jährlich bis zu 10 Millionen Menschen an antibiotikaresistenten Krankheitserregern sterben1. Antibiotika werden in der Landwirtschaft im Überschuss eingesetzt, aber auch außerhalb der großen Kliniken von Medizinern ohne geeignete diagnostische Verfahren verschrieben. Die Entscheidung, ob Antibiotika verschrieben werden, wird zum Großteil empirisch getroffen. Ein zentraler Bestandteil der Lösung dieser Problematik ist die Entwicklung schneller und spezifischer Diagnosemethoden (Point-of-Care-devices, POC). Dies könnte zu einer umfassenden Verringerung des Medikamentenkonsums führen und somit die weitere Ausbreitung der Antibiotikaresistenzen minimieren. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines solchen Diagnoseverfahrens. Diese Arbeit bezieht sich dabei auf drei Publikationen, die einen wesentlichen Beitrag in diesem Bereich leisten. In der Publikation Low-cost microarray platform to detect antibiotic resistance genes (Publikation 1) behandeln wir eine alternative Methode zur hausinternen Markierung von DNA-Oligonukleotiden, welche für die Signalgebung bei ligationsbasierten DNA-Microarray-Verfahren verwendet werden. Die alternative Markierung basiert auf einer terminalen Desoxynukleotidyltransferase-Reaktion, in welcher die DNA-Oligonukleotide in Gegenwart von Biotin-konjugierten Nukleotiden elongiert werden. Die hausinterne Markierung ermöglicht es, die hohen Kosten durch kommerziell markierte DNA-Oligonukleotide besonders im Fall von Hochdurchsatzverfahren zu reduzieren. Die selbstmarkierten Oligonukleotide zeigten hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität eine vergleichbare Leistung zu kommerziell markierten DNA-Oligonukleotiden, jedoch bei nur zehn Prozent der Kosten3. iv Die Publikation Crosslinking of PCR primers reduces unspecific amplification products in multiplex PCR (Publikation 2) behandelt die Problemstellung der Multiplex- Polymerasekettenreaktion (PCR). Die PCR ist für DNA-basierte Diagnosemethoden unerlässlich. Multiplex-PCRs sind besonders attraktiv, da sie die Anzahl der Einzelreaktionen reduzieren. Die Multiplexeffizienz wird jedoch durch Primer-Wechselwirkungen, wie zum Beispiel die Bildung von Primer-Dimeren, beeinträchtigt. In dieser Studie wurde eine kovalente Querverknüpfung von Primern über ihre 5'-Enden verwendet, um die unerwünschten Effekte zu vermeiden. Die Spezifität der Primer sowie die Effizienz der PCR konnten durch Primer-Querverknüpfung erhöht werden, was in PCRs mit bis zu 34 Primer-Paaren, abzielend auf die wichtigsten Antibiotika-Resistenzgene, im Vergleich zu nicht querverknüpften Primern nachgewiesen werden konnte4. In der Veröffentlichung Full pathogen characterisation: Species identification including the detection of virulence factors and antibiotic resistance genes via multiplex DNA-assays (Publikation 3) wurde ein DNA-basierter Microarray entwickelt, der parallel auf 45 Sepsis-relevanten pathogenen Spezies, 360 Virulenzfaktor- und 409 Antibiotika-Resistenzgene prüft. Der Assay wurde mit 14 multiresistenten Stämmen evaluiert, darunter alle ESKAPE-Pathogene. Die verwendete Plattform wurde hinsichtlich Spezifität und Sensitivität optimiert.

Abstract

(Englisch)

The spread of antibiotic resistance is recognised by the European Union (EU) and the World Health Organisation (WHO) as one of the most severe global health threats1. The danger is posed by multiresistant pathogens that are resilient to many of the commonly used antibiotics. Examples of these are carbapenem-resistant and β-lactamase-producing Enterobacteriaceae or the six pathogens that are summarised by the acronym ESKAPE: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter spp. These pathogens represent a major threat, particularly in the clinical field, e.g. during surgery, cancer therapy and for immunocompromised patients. It was estimated that up to 10 million people would die from antibiotic-resistant pathogens per year by 20502. The use of antibiotics is excessive in agriculture and aquaculture; moreover, in human healthcare, they are often prescribed by physicians without suitable diagnostic procedures. The decision of whether to prescribe antibiotics is mostly made empirically. A key component in solving this problem is the development of fast and specific diagnostic methods, e.g. Point-of-Care-devices (POC), which could lead to an overall reduction in drug consumption. The aim of this thesis is the development of such a diagnostic system. This work refers to three publications that provide a significant contribution in this area. The publication Low-cost microarray platform to detect antibiotic resistance genes (publication 1) describes an alternative method for in-house labelling of DNA oligonucleotides. DNA oligonucleotides are used for signalling in DNA microarray assays; commercially labelled DNA oligonucleotides are associated with high costs. The alternative labelling method is based on a terminal deoxynucleotide transferase reaction. In this approach, the DNA oligonucleotides were labelled during an elongation step in the presence of biotin-conjugated nucleotides. This step was essential to adapt our DNA microarray assay into a high-throughput assay because they were required in large quantities. The self-labelled DNA detection oligonucleotides performed equally well in terms of sensitivity and specificity compared to commercially labelled detection oligonucleotides at only ten per cent of their costs3. ii The publication Crosslinking of PCR primers reduces unspecific amplification products in multiplex PCR (publication 2) deals with the problem of the multiplex polymerase chain reaction (PCR). PCR is essential for DNA-based diagnostic methods; in this case, multiplex PCRs are very attractive as they decrease the number of reactions. On the other hand, the multiplexing efficiency is impaired by primer interactions, e.g. dimer formation. In this publication, covalently crosslinked primers were used to avoid these undesired side effects. Besides the efficiency, the specificity of the primers could be increased by primer crosslinking in PCRs comprising up to 34 primer pairs targeting the most crucial antibiotic resistance genes in one multiplex reaction4. In our publication Full pathogen characterisation: Species identification including the detection of virulence factors and antibiotic resistance genes via multiplex DNA-assays (publication 3), we developed a DNA microarray-based assay that screens for the most critical sepsis-relevant 45 pathogenic species, 360 virulence factors, and 409 antibiotic resistance genes in parallel. The assay was evaluated with 14 multidrug-resistant strains, including all ESKAPE pathogens. The used platform was optimised regarding specificity and sensitivity.

Autor*innen

Noa Wolff

Haupttitel (Englisch)

Development of a DNA-based multiplex assay to characterise pathogens and their antibiotic resistance and virulence factor genes

Paralleltitel (Deutsch)

Entwicklung eines DNA-basierten Multiplex-Assays zur Charakterisierung von Pathogenen und deren Antibiotikaresistenz- und Virulenzfaktorgenen

Publikationsjahr

2020

Umfangsangabe

iv, 119 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Inge Gyssens ,

Winfried Neuhaus

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC16105948

Utheses ID

57681

Studienkennzahl

UA | 794 | 685 | 437 |

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Schlagwörter