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DEAD-box protein facilitated folding of the group II intron ai5g in vivo

Andreas Liebeg

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Christina Waldsich

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DOI

10.25365/thesis.6425

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29148.38930.167066-5

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das Gruppe II Intron Ai5γ, welches im mitochondriellen Genom von Hefe zu finden ist, besitzt die Fähigkeit sich selbst aus dem Transkript herauszuschneiden. Um dies bewerkstelligen zu können muss dieses sehr große RNA Molekül eine komplizierte Struktur einnehmen. Die Faltung ist dabei in vitro von einer hohen Konzentration an mono- und divalenten Ionen abhängig. Im zellulären Kontext, wo diese hohen Konzentrationen nicht verfügbar sind, unterstützen Proteine bei dieser Aufgabe. Im Falle von Ai5γ wurde das DEAD-box Protein Mss116p als notwendiger Kofaktor bei der Faltung von Ai5γ identifiziert. In der vorliegenden Diplomarbeit wurde das Gruppe II Intron Ai5γ in Bezug auf seine Struktur in vivo untersucht. Dabei war ich insbesondere an strukturellen Unterschieden von Ai5γ zwischen einem Hefestamm, dessen genetischer Hintergrund dem Wildtyp entspricht, und einer Variante, in welcher Mss116p durch eine Resistenzkassette ausgetauscht wurde, interessiert. Dadurch sollte die Funktion von Mss116p im Zusammenhang mit RNA Faltung beleuchtet werden. Um strukturelle Information über Ai5γ im zellulären Kontext zu erhalten, benutzte ich Dimethylsulfat (DMS). DMS penetriert die Hefezelle und ihre Kompartimente rasch und methyliert N1 von Adenosin und N3 von Cytosin, wenn diese nicht durch Wasserstoffbrücken oder gebundenen Kofaktoren geschützt werden. Diese Informationen geben Aufschluss sowohl über Interaktionen auf der Ebene der Sekundär- als auch der Tertiärstruktur. Nach der Optimierung der Methode habe ich zuerst die Struktur von Ai5γ in vivo untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass, bis auf eine Ausnahme in Domäne 2, alle Sekundarstrukturelemente, wie zuvor postuliert, ausgebildet sind. Außerdem sind alle Tertiärinteraktionen bis auf eine Ausnahme vorhanden, was darauf schließen lässt, dass auch das aktive Zentrum des Ribozyms in vivo ausgebildet ist. Modifikationen der betreffenden Bereiche zeigten, dass der größte Teil der Ai5γ Moleküle nicht mehr an ihr Substrat gebunden sind. Konsistent damit fanden wir in einem “in vivo splicing assay” heraus, dass der Großteil der Population im geschnittenen Zustand vorliegt. Daraus lässt 81 sich schließen, dass das Gruppe II intron Ai5γ nach ihrem Herausschneiden ihre Struktur inklusive aktivem Zentrum erhält und für den Vorgang der Reinsertion keine bedeutenden Änderungen der Struktur nötig sind. In einem Hefestamm, bei dem Mss116p entfernt wurde, zeigte sich, dass die Struktur von Ai5g stark gestört vorliegt, was sich auch im Fehlen von geschnittener mRNA zeigt. Die Sekundärstruktur bildet sich hier nicht aus und bleibt sogar unter dem Level von ungefaltetem Ai5γ in vitro. Sämtliche Tertiärinteraktionen fehlen ebenso. Außerdem wurden keine Anzeichen gefunden, dass sich Ai5γ in vivo ohne Mss116p falsch faltet und in einer sogenannten kinetischen Falle verharrt. Ebenso wurde kein Fußabdruck von Mss116p identifiziert, was darauf hinweist, dass Mss116p nicht mehr am nativ gefalteten Gruppe II Intron gebunden ist. Meines Erachtens deuten die Ergebnisse dieser Diplomarbeit darauf hin, dass Mss116p in einem frühen Stadium der Faltung von Ai5γ aktiv ist, da bereits die Sekundärstruktur stark betroffen ist. Da bekannt ist, dass mehrere transiente Zwischenprodukte in der Faltung von Ai5γ entstehen, scheint Mss116p eines dieser Intermediate zu stabilisieren. Um die Faltung in den nativen Zustand zu ermöglichen muss zuerst Mss116p das Gruppe II intron freigeben.

Autor*innen

Andreas Liebeg

Haupttitel (Englisch)

DEAD-box protein facilitated folding of the group II intron ai5g in vivo

Paralleltitel (Deutsch)

DEAD-box Protein unterstütze Faltung des Gruppe II Introns Ai5g in vivo

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

82 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christina Waldsich

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.99 Naturwissenschaften allgemein: Sonstiges

AC Nummer

AC08157101

Utheses ID

5785

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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