Detailansicht
Two dimensional gel electrophoresis (2-DE) and MALDI-TOF-MS
analysis of rDNA derived, therapeutic monoclonal antibodies
Trastuzumab and Rituximab and fusion protein Abatacept
Dasnor Nebija
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Christian Noe
DOI
10.25365/thesis.6447
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30060.31178.791966-1
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die vorrangige Zielsetzung dieser Arbeit war die Evaluation der zweidimensionalen Gelelektrophorese 2-DE in Verbindung mit MALDI-TOF-MS in Hinblick auf ihre Eignung für die qualitative Charakterisierung und Identifizierung der humanisierten und der chimären rmAbs Trastuzumab und Rituximab, sowie des Fusionsproteins Abatacept nach dem tryptischen Verdau. Des Weiteren wurde der Einfluss der posttranslationalen Modifikation dieser Proteine auf ihres elektrophoretischen Verhaltens untersucht. Außerdem wurden an Trastuzumab Zersetzungsuntersuchungen unternommen, um die Eignung von Stabilitätsstudien der 2-DE zu bewerten.
Für die Bestimmung des Molekulargewichtes und die Optimierung der Deglycosilierungsreaktion wurde 1-DE und 2-DE sowohl unter reduzierenden als auch nicht reduzierenden Bedingungen verwendet. Weiters wurden mittels 2-DE die isoelektrischen Punkte bestimmt. Bei Rituximab und Trastuzumab zeigten 2-DE Gele charakteristisches Immunglobulin-Migrationsverhalten, das in höchst komplexen Spotmustern resultiert. Abatacept wiederum zeigte die charakteristischen Spotmuster der Fusionsproteine.
Die Beteiligung von N-Glycosylierung , terminaler Sialinsäure und C--terminaler Lysin –Verkürzung im 2-DE Spotmuster von Trastuzumab, Rituximab und Abatacept wurden mit Hilfe von N-Glycosidase F, Sialidase und Carboxypeptidase B untersucht. O-Glycosidase wurde für die Abspaltung der O-Glykane verwendet.
Die Methode der Peptidmassen-Fingerprints (PMF) wurde für die Identifizierung von Trastuzumab, Rituximab und Abatacept angewandt. Ausgewählte Proteinspots wurden im Gel einem tryptischen Verdau unterzogen und sodann die Peptidmassen der MALDI-TOF-Analyse in silico mit den theoretischen Werten verschiedener Datenbänke verglichen.
Abstract
(Englisch)
The main objective of this study was the evaluation of two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) in combination with MALDI-TOF mass spectrometry, after tryptic digest with regard to suitability for qualitative characterization and identification of humanized and chimeric recombinant monoclonal antibodies (rmAbs) Trastuzumab and Rituximab and fusion protein Abatacept. Moreover, the impact of posttranslational modification of these proteins on the electrophoretic behavior has been evaluated. In addition, in order to assess the stability indicating power of 2-DE, forced degradation studies of Trastuzumab were undertaken.
One-dimensional SDS-PAGE and 2-DE in reducing and nonreducing conditions were used for the assessment of molecular weight, isoelectric point and optimization of the deglycosilation procedure. For Rituximab and Trastuzumab, 2-DE gels revealed characteristic immunoglobulin migration behavior resulting in highly complex spot patterns. On the other hand, Abatacept showed characteristic spot pattern of fusion proteins.
The contribution of N-linked sugars, terminal sialic acids and C-terminal lysine
truncation in 2-DE spot pattern of Trastuzumab, Rituximab and Abatacept, was studied using N-glycosidase F, Sialidase and Carboxypeptidase B. O-glycosidase was used for the release of O-linked glycans.
Peptide mass fingerprinting (PMF) analysis was used for the identification of
Trastuzumab, Rituximab and Abatacept. In-gel tryptic digestion of selected protein spots was performed and peptide masses measured with MALDI-TOF analysis were compared in silico with theoretical peptide masses from different databases.
On the basis of experimental data it is shown that 2-DE in combination with MALDI-TOF-MS and PMF Analysis is a suitable method for fast and reliable identification of rmAbs and fusion proteins.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
monoclonal antibodies fusion protein 2D-Gel electrophoresis MALDI-TOF analysis peptide mass fingerprinting posttranslational modifications
Schlagwörter
(Deutsch)
Monoklonale Antikörper Fusionsprotein 2D-Gelelektrophorese MALDI-TOF Analyse Peptide mass fingerprinting Posttranslationale Modifikationen
Autor*innen
Dasnor Nebija
Haupttitel (Englisch)
Two dimensional gel electrophoresis (2-DE) and MALDI-TOF-MS
analysis of rDNA derived, therapeutic monoclonal antibodies
Trastuzumab and Rituximab and fusion protein Abatacept
Paralleltitel (Deutsch)
Zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) und MALDI-TOF-MS Analyse der rekombinanten therapeutischen monoklonalen Antikörper Trastuzumab und Rituximab und des Fusionsproteins Abatacept
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
XVI, 235 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Theo Dingermann ,
Hermann Wätzig
Klassifikationen
44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika ,
44 Medizin > 44.42 Pharmazeutische Chemie
AC Nummer
AC05040620
Utheses ID
5806
Studienkennzahl
UA | 091 | 449 | |