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Regulatory mechanisms of the naïve to formative pluripotency transition
Andreas Lackner
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (DissG: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Martin Leeb
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-15215.00486.396173-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Der Austritt aus der naiven Pluripotenz wird in vitro durch Freisetzung von embryonalen Stammzellen aus 2i-Medium rekapituliert und durch Rex1GFPd2 in hoher Auflösung robust visualisiert. Basierend auf einem Transposon-basierten Sättigungsscreen in haploiden ES-Zellen, die diesen Rex1GFPd2-Reporter tragen, generierten wir ein KO-ES-Zell-Repositorium für insgesamt 117 Gene. Wir untersuchten die Genexpression in KO-Zelllinien von 73 Genen zusammen mit Wildtyp (WT)-Zellen mittels RNA-Sequenzierung, im Stammzellstadium und während des Ausstiegs aus der Pluripotenz als Paradigma für eine Säugetier-Zellschicksalsentscheidung. Vergleichende Analysen zeigten, dass die in vitro eingesetzten Mechanismen auch in vivo während des Übergangs vom naiven zum formativen Epiblasten aktiv sind. Die Verwendung von 74 (73 KOs und WT-Zellen) Transkriptomen ermöglichte es uns, ein erweitertes naives Netzwerk von 496 Genen zu identifizieren, die naiven assoziierten Gene (NAGs), die eng mit der naiven Markerexpression in vitro und dem in vivo Ausgang aus der Pluripotenz in Maus und Primaten verbunden sind. Integrierte Analysen von KO-Transkriptomen definierten Gennetzwerke, die mehreren KOs nachgeschaltet sind, und zeigten Überschneidungen mit regulatorischen Pfaden. Ein charakteristisches Merkmal des formativen Zustands ist der Verlust der ES-Zell-Identität ohne den Erwerb einer späteren Spezifikation. In einem Ansatz auf Gen-Ebene untersuchen wir den Beitrag des Polycomb repressiven Komplexes 2 (PRC2) und seines Co-Faktors Jarid2 zum Verlust der naiven Identität. Wir generierten Chromatinimmunoprezipitationsdaten von H3K27me3 als einen potentiellen Mechanismus zur Unterstützung der Abschaltung des naiven genregulatorischen Netzwerks (GRN), im Stammzellstadium und nach 24 Stunden Differenzierung. Interessanterweise ist H3K27me3 global reduziert in der Differenzirung, obwohl es an NAGs und naiven Markergenen erhöht ist. Durch die Integration von Transkriptom-Profilen von Jarid2-KO-Zellen und Chromatin-Bindungskarten von Jarid2 in WT-Zellen identifizieren wir direkte Targets von Jarid2 und bringen sie mit der in Jarid2-KO-Zellen beobachteten Differenzierungsverzögerung in Verbindung. Jarid2 vermittelt H3K27me3 an einer Untergruppe von Genen während des Umschaltens von der naiven zur formativen Phase und ist an der Repression verschiedener Signalwegkomponenten, naiver Marker und NAGs während des Austritts aus der naiven Pluripotenz beteiligt. Zusammenfassend stellen wir fest, dass Jarid2 für die effiziente de novo Methylierung von H3K27 an NAGs und anderen funktionellen Genen notwendig ist und so zur rechtzeitigen Stilllegung des naiven GRN beiträgt.
Abstract
(Englisch)
The exit from naïve pluripotency is recapitulated in vitro by releasing embryonic stem cells from 2i medium and is robustly visualized by Rex1GFPd2 in high resolution. Based on a transposon-based saturation screen in haploid ES cells carrying this Rex1GFPd2 reporter, we generated a KO ES cells repository for a total of 117 genes. We profiled KO cell lines of 73 genes together with wildtype (WT) cells by RNA sequencing in self-renewal and during the exit from pluripotency as a paradigm for a mammalian cell fate decision. Comparative analysis showed that the mechanisms engaged in vitro are also active in vivo during the transition of the naïve to the formative epiblast. The use of 74 (73 KOs and WT cells) transcriptomes enabled us to identify an extended naïve network of 496 genes, the naïve associated genes (NAGs), tightly linked to the naïve marker expression in vitro and the in vivo exit from pluripotency in mouse and primates. Integrated analysis of KO transcriptomes defined gene networks downstream of several KOs and showed intersection with regulatory pathways. A characteristic feature of the formative state is the loss of ES cell identity without lineage specification. In a gene-level approach, we investigate the contribution of the Polycomb repressive complex 2 (PRC2) and its co-factor Jarid2 to the loss of naïve identity. We profile H3K27me3 as a potential mechanism to support the shutdown of the naïve gene regulatory network (GRN), in self-renewal, and after 24h of differentiation. Interestingly, H3K27me3 is reduced globally during differentiation despite being increased at NAGs and naïve marker genes. Integrating transcriptome profiles of Jarid2 KO cells and chromatin binding maps of Jarid2 in WT cells, we identify direct targets of Jarid2 and connect them to the differentiation delay observed in Jarid2 KO cells. Jarid2 mediates H3K27me3 at a subset of genes during the naïve to formative switch and engages in the repression of the several signaling pathway components, naïve markers, and NAGs during the exit from naïve pluripotency. In sum, we find that Jarid2 is necessary for efficient deposition of newly established H3K27me3 at NAGs and other functional genes, contributing to the timely decomissioning of the naïve GRN.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Exit from naive Pluripotency Epigenetics Signaling
Schlagwörter
(Deutsch)
Pluripotenz Epigenetik Signaltransduktion
Autor*innen
Andreas Lackner
Haupttitel (Englisch)
Regulatory mechanisms of the naïve to formative pluripotency transition
Paralleltitel (Deutsch)
Regulatorische Mechanismen des Übergangs von naiver zu formativer Pluripotenz
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
160 Seiten : Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Gerda Egger ,
Luis Morey
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC16169592
Utheses ID
58144
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 490 |
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