Detailansicht
Identification, cloning and heterologous expression of cryptic gene clusters for natural product biosynthesis
Vera Simeoni
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Sergey Zotchev
DOI
10.25365/thesis.65781
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-21282.53834.314752-0
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die zunehmende Anzahl von Krankheitserregern, die gegen alltäglich verwendete Antibiotika resistent werden, ist sehr besorgniserregend. Professor Landecker veranschaulicht dieses gegenwärtige Problem mit folgender Aussage: „Lösungen sind zu Problemen geworden“ [46]. Actinomyceten haben die Gabe, neue bioaktive Komponente mit einer hohen chemischen und strukturellen Vielfalt zu produzieren.
Der Fokus dieses Projektes lag auf zwei potentiell interessanten, biosynthetischen Genclustern von Amycolatopsis sp. YIM 10. Durch Verwendung von computergestützten „Genome Mining“ Tools wurde vorhergesagt, dass Cluster 11 eine NRPs-ähnliche Komponente produzieren würde und Cluster 17 hingegen ein Arylpolyen und ein Ladderan. Cluster 11 und Cluster 17 wurden jeweils in den „Pendelvektor“ pCLY10 geklont.
Der Großteil dieses Projekts bezieht sich auf das Cluster 11, das im Zuge der in Hefe basierten DNA-Assemblierungstechnik erfolgreich vereinigt wurde.
Für dessen heterologe Expression wurden Streptomyces coelicolor M1154 und Streptomyces albus Del14 verwendet mit dem Ziel, Cluster 11 zu aktivieren.
Extrakte der Kulturen beider Stämme, die das Konstrukt pVS_C11 enthielten, zeigten weder im Agardiffusionstest, noch während der HPLC-Analyse neue Resultate im Vergleich zu jenen Extrakten, die den leeren Vektor pCLY10 enthielten.
Deswegen wurden in einem zweiten Schritt die Transkriptionsregulatorgenen vom LuxR- und SARP-Typ von Cluster 11 überexprimiert. Anschließend wurde wieder eine HPLC-Analyse durchgeführt, Streptomyces coelicolor M1154 mit pVS_C11 + SARP, zeigte einen neuen Peak bei Minute 21,9.
Nach LC-MS Analysen kombiniert mit „Genome Mining“ Techniken wurde aufgezeigt, dass rekombinante Stämme mit pVS_C11 + SARP, aber auch jene die den leeren Vektor pCLY10 enthielten, vermeintliche Spoxazomicin A/B- und Tetroazolemycin A/B-Derivate produzieren. Diese Moleküle werden wahrscheinlich vom Genom des Wirtsorganismus kodiert.
Abstract
(Englisch)
The rising number of pathogens becoming resistant against daily used antibiotics is very concerning. As Professor Landecker defines it: “Solutions have become problems” [46].
Actinomycetes have the gift for the production of novel bioactive compounds with a high chemical and structural diversity.
The focus of this project was on two potentially interesting BGCs of Amycolatopsis sp. strain YIM 10. Using different “in silico” genome mining tools, BGC11 was predicted to produce a NRPs-like compound, BGC17 an arylpolyene and ladderane. Both BGCs were respectively cloned into the shuttle vector pCLY10.
Most part of the project is related to BGC11. After the yeast-based DNA assembling technique of BGC11, a heterologous expression in Streptomyces coelicolor M1154 and Streptomyces albus Del14 was carried out with the aim of activating BGC11.
Extracts of the cultures of both strains harboring pVS_C11 didn’t deliver any new results in disk diffusion tests or in HPLC-analysis compared to extracts containing the empty vector pCLY10.
Subsequently an overexpression of the transcriptional regulator genes of BGC11 from the SARP and LuxR-type was performed. HPLC-analysis of the extracts were carried out where the extract of Streptomyces coelicolor M1154/pVS_C11 + SARP showed a new peak at min 21,9.
After LC-MS analysis combined with genome mining analysis, it was shown that recombinant strains harboring pVS_C11 + SARP but also strains harboring the empty vector pCLY10 and no SARP produced inter alia compounds which are presumably spoxazomicin A/B- and tetroazolemycin A/B, indicating that these compounds are encoded by the genome of the host organism.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Natural products cryptic gencluster heterologous expression antibiotic resistance
Schlagwörter
(Deutsch)
Naturprodukte/ kryptische Gencluster/ heterologe Expression/ Antibiotikaresistenz
Autor*innen
Vera Simeoni
Haupttitel (Englisch)
Identification, cloning and heterologous expression of cryptic gene clusters for natural product biosynthesis
Paralleltitel (Deutsch)
Identifizierung, Klonierung und heterologe Expression von kryptischen Genclustern für die Biosynthese von Naturprodukten
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
IV, 80 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Sergey Zotchev
AC Nummer
AC16267458
Utheses ID
58263
Studienkennzahl
UA | 449 | | |