Detailansicht
Characterization of Bet v 1-specific nanobodies for passive treatment of type I allergy
Ines Zettl
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Biologische Chemie
Betreuer*in
Mark Somoza
DOI
10.25365/thesis.75266
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-24397.38022.710665-8
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Typ I Allergie ist ein immer größer werdendes Gesundheitsproblem, das fast 30% der Menschen auf der ganzen Welt betrifft. Vor allem in der nördlichen Hemisphäre sind Birkenpollen eine weit verbreitete Allergenquelle, die allergische Symptome wie Heuschnupfen oder Asthma in über 100 Mio. Patienten auslöst und dadurch die Lebensqualität verringert.
Zurzeit werden zwei Behandlungsformen angeboten: symptomatische Medikamente (z.B. Antihistaminika) und allergen-spezifische Immuntherapie (AIT). Während Antihistaminika nur einen temporären Effekt haben, bietet AIT einen lang anhaltenden Schutz durch blockierende IgG Antikörpern, die nach der Injektion von Allergenextrakten oder, seit kurzem, Hypoallergenen gebildet werden. AIT wird allerdings mit einem aufwändigen Zeitplan für die Injektionen über mehrere Jahre sowie möglichen allergische Reaktionen, wenn Allergenextrakte verwendet werden, in Verbindung gebracht.
Neben symptomatischer Medikation und AIT gibt es noch eine dritte Option, nämlich passive Immunisierung, die das Interesse von Forschern geweckt hat. Erst kürzlich wurde gezeigt, dass die Verabreichung von allergen-spezifischen monoklonalen IgG Antikörpern die Bindung von IgE Antikörpern an das entsprechende Allergen inhibiert, weiters IgE-vermittelte Effekte an verschiedensten Immunzellen verhindert und somit allergische Symptome reduziert. Da die Herstellung von monoklonalen IgG Antikörpern aufwändig und teuer ist, wurde eine willkommene Alternative in Form von Nanobodies gefunden. Nanobodies stammen von „heavy-chain antibodies“ (Antikörper, die nur aus schweren Ketten bestehen) ab, die im Blut von Kameliden (z.B Kamele und Lamas) entdeckt wurden. Diese Einzeldomänen-Antikörperfragmente sind chemisch stabil, ohne großem Aufwand zu produzieren und erkennen eine Vielzahl an verschiedenen Epitopen, was auf ihre strukturellen Eigenschaften zurückzuführen ist. Des Weiteren sind sie hochspezifisch und hochaffin.
Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von Nanobodies, die spezifisch für das Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 sind, um ihre Anwendung als passive Behandlungsmethode von Allergie zu evaluieren. Nanobodies wurden durch die Immunisierung eines Kamels gebildet, isoliert und in E. coli exprimiert. Die Spezifität, Kreuzreaktivität und die Position des Epitops wurden durch ELISAs ermittelt. Die Affinität wurde mittels Oberflächenplasmonenresonance (surface plasmon resonance, SPR) gemessen. Schließlich wurden Inhibitions-ELISAs und RBL cell assays durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Nanobodies die Bindung von polyklonalen IgE Antikörpern aus Patientenseren an Bet v 1 inhibieren und Bet v 1-induzierte Aktivierung von Basophilen verhindern können.
Es wurden drei hochaffine Bet v 1-spezifische Nanobodies (Nb23, Nb24 und Nb32) isoliert, die außerdem zwei wichtige kreuzreaktive Allergene erkennen: Aln g 1 aus der Erle und Cor a 1 aus der Hasel. Als Bindungsstelle für die Nanobodies auf Bet v 1 wurde die C-terminale α-Helix identifiziert. Alle drei Nanobodies können die Bindung von polyklonalem IgE an Bet v 1, Aln g 1 und Cor a 1 inhibieren. Des Weiteren reduziert Nb32, repräsentativ für alle drei Nanobodies, die Aktivierung von Basophilen durch Bet v 1.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich Nb32 aufgrund seiner hoher Affinität, Kreuzreaktivität und die Fähigkeit IgE-Bindungen an Bet v 1 zu inhibieren als potenzieller Kandidat für eine zukünftige Behandlungsmethode von Allergie qualifiziert hat. Wir schlagen Nb32 als Komponente eines Nanobody-Cocktails vor, welcher als „proof of concept“ in einem experimentellen Tiermodell untersucht werden sollte, um vielversprechende, auf Nanobodies basierende Medikamente zu identifizieren, die durch Birkenpollen hervorgerufene allergische Symptome mildern können.
Abstract
(Englisch)
Type I allergy is an increasing world-wide health problem affecting almost 30% of the population. Especially in the northern hemisphere, birch pollen is a prevalent allergen source that triggers allergic symptoms such as hayfever and asthma in over 100 million patients, resulting in a decreased quality of life.
So far, two types of medication are on the market: symptomatic treatment (e.g. antihistamines) and allergen-specific immunotherapy (AIT). While the effect of antihistamines is temporary, AIT is the only treatment so far that offers a long-lasting protection by inducing blocking IgG antibodies with allergen extracts or, more recently, hypoallergenic derivates. However, AIT is associated with time-consuming schedules over several years and if based on application of allergen extracts with side effect, e.g. possible allergic reactions to the given allergens.
Besides symptomatic medication and AIT a third option, passive immunization, has raised the interest of researchers. Recent studies have shown that administration of allergen-specific monoclonal IgG antibodies results in inhibition of IgE antibodies binding to the respective allergen, further in prevention of IgE-mediated effects on various immune cells and thus reduces allergic symptoms in patients. However, the generation and production of monoclonal IgG antibodies is laborious and expensive. A welcome alternative was found in nanobodies that derive from heavy-chain antibodies discovered in camelids such as camels and llamas. Those single-domain antibody fragments are chemically stable, easy to produce and recognize a variety of different epitopes due to their structural features while exhibiting high affinity and specificity.
The aim of this thesis was to characterize nanobodies specific for Bet v 1, the major birch pollen allergen, and evaluate if they are applicable for passive treatment of allergy. Nanobodies were raised in camels and expressed in E. coli. Specificity, cross-reactivity and epitope location were investigated by ELISAs. Affinity measurements were conducted using surface plasmon resonance (SPR). Finally, the ability to block polyclonal IgE from patients’ serum and inhibit basophil activation was assessed by inhibition ELISAs and RBL cell assays.
We isolated three high-affine Bet v 1-specific nanobodies (Nb23, Nb24 and Nb32) that also recognize two important cross-reactive allergens, Aln g 1 from alder and Cor a 1 from hazel. The binding site on Bet v 1 was mapped to the alpha helix on the C-terminus. Our results showed that the nanobodies were able to inhibit polyclonal IgE binding to Bet v 1, Aln g 1 and Cor a 1. Furthermore, Nb32, as a representative for all three nanobodies, reduced Bet v 1-induced activation of basophils.
In conclusion, the combined features of high-affinity, cross-reactivity and ability to inhibit IgE binding to Bet v 1 qualified Nb32 a potential candidate for a prospective passive treatment of allergy. We suggest Nb32 as one component for a nanobody cocktail that should be evaluated in a proof of concept testing in experimental animal models for efficacy to identify promising nanobody-based drugs to reduce birch pollen related allergic symptoms.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
allergy Bet v 1 Nanobody VHH IgE competitor
Schlagwörter
(Deutsch)
Allergie Bet v 1 Nanobody VHH IgE Konkurrent
Autor*innen
Ines Zettl
Haupttitel (Englisch)
Characterization of Bet v 1-specific nanobodies for passive treatment of type I allergy
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung von Bet v 1-spezifischen Nanobodies für die passive Behandlung von Typ-I-Allergie
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
78 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Mark Somoza
AC Nummer
AC16150990
Utheses ID
58277
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |