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Optimization of breast cancer cell spheroids for co-culture with archaea

Lara Susanna Lang

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Manfred Ogris

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DOI

10.25365/thesis.69631

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-11103.40670.533076-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Nach konventionellen Krebstherapien, wie beispielsweise der antineoplastischen Chemotherapie, der chirurgischen Tumorresektion oder der Radiotherapie, treten oft Rezidive oder Resistenzen bei Krebspatienten auf. Ein innovativer Therapieansatz, um den Krebs spezifischer zu bekämpfen, bedient sich der Einschleusung von therapeutisch wirksamem Genmaterial in Krebszellen. Um den Transfer der hochpolaren Substanzen zum Zielort zu ermöglichen und Schutz vor enzymatischem Abbau zu bieten, ist ein effizienter Vektor-vermittelter Transport erforderlich. In einigen präklinischen Studien, in vitro aber auch anhand von Tierversuchen, wurde bereits die Fähigkeit von anaeroben Bakterien, spezifisch Tumore zu besiedeln, untersucht. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde die Kultur dreidimensionaler Tumorsphäroide (MCTS) aus 4T1-Zellen (murine Brustkrebszelllinie) für die Darstellung einiger wichtiger Hauptmerkmale solider Tumore optimiert. Um reproduzierbare MCTS erstellen zu können, wurden mehrere Arbeitsverfahren etabliert und verbessert. Diese umfassten das Aussäen der Zellen in Spezial-Mikrotiterplatten, die Ernte der Sphäroide, das Anfertigen von Cryostat-Dünnschnitten und die Fixierung der Sphäroide. MCTS, die aus unterschiedlichen Zellzahlen (20,000 | 10,000 | 5,000 | 1,000 | 500 | 200 Zellen) generiert worden waren, wurden hinsichtlich ihrer mechanischen Festigkeit, ihrer Reproduzierbarkeit, ihrer Morphologie, ihres Wachstums und der etwaigen Entwicklung eines nekrotischen Kerns untersucht. Dafür wurden die Sphäroide zu verschiedenen Zeiten geerntet und genannte Parameter anhand von Dünnschnitten beurteilt. Jene Sphäroide, die aus 5.000 oder 10.000 Zellen kultiviert worden waren, wiesen die günstigsten Eigenschaften auf und wurden daher für finale Experimente ausgewählt. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob die generierten Sphäroide geeignete in vitro Tumormodelle für Co-Kultur-Experimente mit der anaeroben, methanogenen Archchaeen-Spezies Methanococcus maripaludis S0001 darstellten. Hierfür wurden die optimierten MCTS (5k und 10k) zunächst mit verschiedenen Archaeen- Konzentrationen (3.6x107 oder 3.2x105) unterschiedlich lange (24 h, 48 h, 96 h, 120 h, 168 h) inkubiert und währenddessen das Kolonisierungsmuster der Archaeen beobachtet. Um die Mikroorganismen im Tumorsphäroid mikroskopisch identifizieren 9 zu können, wurden verschiedene Farbstoffe (HOECHST, DAPI, Alexa Fluor 488) für die Färbung der verwendeten Archaeen-Spezies getestet. Im Zuge der Co-Kultur- Experimente wurden M. maripaludis auf ihre Fähigkeit, innere Schichten (hypoxische/nekrotische Bereiche) der Sphäroide zu infiltrieren, untersucht. Die Ergebnisse der Fluoreszenz-Mikroskopie deuten darauf hin, dass ausgewählte Sphäroide durchaus geeignete in vitro Modelle für die Erforschung der Eigenschaft von Archaeen, sich in Richtung hypoxischer Umgebung zu bewegen, darstellen könnten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass M. maripaludis S0001 in der Lage ist, sich in Abhängigkeit von der Zeit spontan in Richtung innerer Schichten der Sphäroide zu bewegen. Dies lässt vermuten, dass Hypoxie/Anoxie innerhalb der MCTS einen Effekt auf die Migrationsrichtung dieser Mikroorganismen haben könnte.

Abstract

(Englisch)

Conventional anticancer therapies, such as antineoplastic chemotherapy, surgical resection or radiotherapy, are frequently followed by relapse and the occurrence of resistance in cancer patients. The introduction of exogenous therapeutic genetic material into target cells represents a novel approach to tackle cancer more specifically. To enable transfer to desired sites and to provide protection against enzymatic degradation, efficient vector mediated transportation is required. Several investigations on anaerobic bacteria as tumor-targeting gene delivery vectors have been conducted in vitro as well as through animal experimentations in the past. In the course of this thesis, three-dimensional multicellular tumor spheroids (MCTS) were generated from 4T1 cells (murine mammary cancer cell line) and optimized in order to display relevant main features of natural tumors. For the formation of reproducible MCTS, several operating procedures including cell seeding in specialized well plates, harvesting, cryostat sectioning, and fixation were established and improved. Spheroids of different seeded cell numbers (20,000 | 10,000 | 5,000 | 1,000 | 500 | 200 cells) were compared with regard to various parameters, such as mechanical stability, reproducibility, consistent morphological shape, steady growth, and development of a necrotic core. Said properties were assessed through the harvesting of MCTS at different times and the subsequent preparation of thin sections. MCTS initially comprising of 5,000 or 10,000 cells were considered the models with the most favorable features and were hence selected for final experiments. Furthermore, MCTS were investigated for their suitability as in vitro tumor model systems for co-culture studies with the anaerobic methanogenic archaea strain Methanococcus maripaludis S0001. As part of the experiment, optimized MCTS (5k and 10k) were incubated with different concentrations of archaea per spheroid (3.6x107 or 3.2x105) for various periods of time (24 h, 48 h, 96 h, 120 h, 168 h) during which archaea’s colonization patterns were observed. To visualize the microorganisms among cancer cells, different dyes (HOECHST, DAPI, Alexa Fluor 488) were tested for their applicability to label the used archaea strain. During co-culture experiments, the ability of M. maripaludis to infiltrate inner spheroid zones (hypoxic/necrotic regions) was assessed. 7 The results obtained from fluorescence microscopy suggest that, within a distinct setup, MCTS could represent appropriate models for the investigation of archaeal infiltration of hypoxic regions of tissues in vitro. Moreover, the collected data indicates that M. maripaludis S0001 is capable of spontaneously proceeding towards inner layers of MCTS over time, suggesting that hypoxia/anoxia within spheroids might have a “pulling effect” on the microorganism.

Autor*innen

Lara Susanna Lang

Haupttitel (Englisch)

Optimization of breast cancer cell spheroids for co-culture with archaea

Paralleltitel (Deutsch)

Optimierung von Brustkrebszell-Sphäroiden für die Ko-Kultur mit Archaeen

Publikationsjahr

2021

Umfangsangabe

109 Seiten : Illustrationen

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Manfred Ogris

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.99 Naturwissenschaften allgemein: Sonstiges ,

35 Chemie > 35.71 Biochemische Methoden ,

44 Medizin > 44.35 Histologie ,

44 Medizin > 44.42 Pharmazeutische Chemie ,

58 Chemische Technik > 58.20 Chemische Technologien: Allgemeines

AC Nummer

AC16258930

Utheses ID

59143

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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Schlagwörter