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Identification of small RNAs in Staufen2 complexes from rat brain

Sabine Spath

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Anetta Konecna

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29190.66077.912259-8

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

MikroRNAs (miRNAs) sind ~22 nt lange, nicht kodierende RNAs, welche Gene post-transkriptionell regulieren können, indem sie die Translation hemmen oder den Abbau der mRNA auslösen. Im Nervensystem spielen miRNAs eine zentrale Rolle in der Entwicklung und wahrscheinlich auch bei der synaptischen Plastizität. Hierfür sind RNA-bindende Proteine (RBPs), welche mRNAs an die Synapsen lokalisieren, ebenso wichtig wie eine Stimulus-abhängige lokale Proteinsynthese. Während des Transports ist die Translation der mRNAs in neuronalen Ribonukleoprotein-Partikeln (RNPs) unterbunden, was entweder durch Regulator-Proteine oder durch miRNAs bewerkstelligt werden kann. Das im Kiebler Labor untersuchte Protein Staufen2 (Stau2) gehört zur Familie der dsRBPs und wird hauptsächlich im Nervensystem exprimiert. In der Taufliege Drosophila melanogaster spielt es eine Rolle bei der Gedächtnisbildung. In hippokampalen Neuronen stellen Staufen-Proteine wichtige Komponenten in RNA-enthaltenden Partikeln dar, welche sich bis in die distalen Dendriten erstrecken. Kürzlich wurde ein Zusammenhang zwischen Stau2 und miRNAs vorgeschlagen, da der Export von Stau2 aus dem Kern von Exportin-5 abhängig ist, dem primären Exportfaktor für Vorläufer-miRNAs. Deshalb war die Hauptaufgabe dieses Projekts zu untersuchen, ob kleine nicht-kodierende RNAs, im Besonderen miRNAs, in Stau2 Partikeln enthalten sind. Über Immunoprezipitationen mit affinitätsgereinigten Antikörpern gegen Stau2 gelang es, Stau2 RNPs mit allen enthaltenen Proteinen und RNAs zu isolieren. Auf Proteinebene wurden verschiedene RISC-assoziierte Komponenten wie Ago, PACT, FMRP und eIF6 in Stau2 Komplexen gefunden, was auf eine Beteiligung von miRNAs hindeutet. Auf RNA-Ebene gelang mittels radioaktiver Markierung von RNA der Nachweis kleiner RNAs mit einer Größe von 20-22 nt in den Stau2 Komplexen. Dies ist ein weiterer Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen miRNAs und Stau2 Partikeln. Zusätzlich wurde das Vorhandensein von miR-18, 26a, 128a, 134 und let-7c in Stau2 Komplexen mittels RT-PCR nachgewiesen. In Folge soll die in den Stau2 Immunoprezipitationen vorkommende RNA kloniert und sequenziert werden, um eine vollständige Liste aller Stau2-assoziierten miRNAs zu erhalten. Eine Hypothese um den Zusammenhang zwischen miRNAs und Stau2 zu erklären, wäre dass miRNAs eventuell eine Funktion in der Inhibierung der Translation von mRNAs in den Stau2 Komplexen erfüllen. Während des Transports sind mRNAs in RNPs durch miRNAs gebunden, was die Translation verhindert. Dies wird später durch einen spezifischen Stimulus aufgehoben, welcher eine lokale Translation an der Synapse ermöglicht.

Abstract

(Englisch)

microRNAs (miRNAs) are ~22 nt long non-coding RNAs which are involved in post-transcriptional gene regulation via mRNA silencing or degradation. miRNAs are abundant in the nervous system, where they have key roles in development and possibly in synaptic plasticity. Both RNA localization as well as stimulus-dependent local protein synthesis critically contribute to synaptic plasticity. During transport, the silencing of mRNAs within neuronal ribonucleoprotein particles (RNPs) can be achieved either by translational regulator-proteins or by miRNAs. Staufen2 (Stau2), an RNA-binding protein (RBP) investigated in the Kiebler lab, belongs to the family of dsRBPs and is mainly expressed in the nervous system. Staufen was shown to be involved in memory formation in Drosophila melanogaster. In hippocampal neurons, Staufen proteins are core components of distinct RNA-containing particles that reach out to distal dendrites. Recent evidence suggested a link between Stau2 and miRNAs. The export of Stau2 from the nucleus depends on Exportin-5, the main export factor for precursor-miRNAs. Therefore, this project aimed at investigating whether small non-coding RNAs, especially miRNAs, are part of Stau2-containing complexes in the rat brain. Immunoprecipitation, using affinity-purified anti-Stau2 antibodies, was performed to isolate Stau2 RNPs including all associated proteins and RNAs. On the protein level, the presence of different RISC-associated components like Ago, PACT, FMRP and eIF6 in Stau2 complexes suggested a participation of the miRNA pathway. On the RNA level, the specific association of small RNAs at the size of 20-22 nt with Stau2 RNPs in E17 rat brain provided further evidence for a connection between miRNAs and Stau2 complexes, as shown by radioactive labeling of RNA isolated after Stau2 immunoprecipitation. In addition, RT-PCR proved the presence of 5 candidate miRNAs, miR 18, 26a, 128a, 134 and let-7c, in Stau2 complexes. In the future, RNA isolated from Stau2 immunoprecipitations will be cloned and sequenced to obtain a complete list of miRNAs associated with Stau2 complexes. A hypothesis to explain this association between miRNAs and Stau2 would be that the miRNA translationally silences its target mRNAs during transport in Stau2 complexes. Upon a specific stimulus, the suppression would be relieved allowing translation to occur at the synapse.

Autor*innen

Sabine Spath

Haupttitel (Englisch)

Identification of small RNAs in Staufen2 complexes from rat brain

Paralleltitel (Deutsch)

Identifizierung von kleinen RNAs in Staufen2 Komplexen aus Rattenhirn

Publikationsjahr

2008

Umfangsangabe

IV, 87 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Michael Kiebler

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC07658694

Utheses ID

592

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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Schlagwörter