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Isolation and characterization of EVs from hiPSC and hiPSC-derived cardiomyocytes
Katharina Anna Kasper
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Franz Gabor
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.69846
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-11129.70334.884331-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind eine Gruppe von Erkrankungen, welche des Herz- Kreislaufsystems betreffen und die am häufigsten verbreitete Todesursache weltweit. Dazu zählen koronare Herzerkrankungen, Myokardinfarkt, periphere arterielle Verschlusskrankheiten, arterielle Hypertonie, sowie indirekt auch Erkrankungen wie Herzrhythmusstörungen, Hypotonie oder Myokarditis. Die Folgen solcher Erkrankungen sind oft sehr schwerwiegend und nicht selten gekennzeichnet durch einen massiven Verlust an Kardiomyozyten. Trotz großer Forschungs- und Studienerfolge im Bereich der Medizin und Pharmazie ist das Wissen über eine Regeneration des Herzmuskels, speziell nach einem Myokardinfarkt, bis zum heutigen Tag noch weitgehend limitiert. Die therapeutische Verwendung von Stammzellen zählt zu einem der größten Erfolge im Bereich der Forschung und bis heute arbeiten Wissenschaftler daran, eine der komplexesten Therapieoptionen in der Klinik zu verbessern. Lange Zeit wurde angenommen, dass implantierte Stammzellen alleine für den Regenerationsprozess des geschädigten Herzmuskelgewebes verantwortlich sind. Mehrere Forschungsergebnisse zeigten aber eine vermeintliche Beteiligung von Faktoren, genauer gesagt Vesikeln, welche aus implantierten Zellen unterschiedlicher Art freigesetzt werden können und den eigentlichen therapeutischen Effekt versprechen. Diese neue Erkenntnis spiegelte sich in zahlreichen neuen Forschungen wieder, woraus sich ein neuer Begriff für genannte Faktoren etablierte, nämlich „Extrazelluläre Vesikel“ (EV). Anhand unterschiedlicher Eigenschaften wie Größe, Dichte, Mutterzelle, aber vor allem anhand der Vesikelbiogenese werden drei unterschiedliche Vesikel-Typen unterschieden: Exosomen, Mikrovesikel und Apoptosekörperchen. Exosomen, welche die kleinste Gruppe bilden und einen Durchmesser von unter 200 nm aufweisen, werden aus sogenannten multivesikulären Endosomen (MVE) generiert. Durch Fusion der MVE mit der Zellmembran wird der Inhalt, sogenannte intraluminale Vesikel, als Exosomen in den extrazellulären Raum freigesetzt. Anders als Exosomen werden Mikrovesikel (~50-1000 nm) durch Abschnürung und Ausstülpung der Zellmembran und Apoptosekörperchen (~50-5000nm) durch kontrollierten Zelltod gebildet. Vesikel klar voneinander zu trennen stellt Forscher jedoch bis heute vor methodische Hindernisse, da eine genaue Zuordnung eine Momentaufnahme erfordert, in welcher die Vesikel von der Zelle freigesetzt werden und die entsprechende Biogenese bestimmt werden kann. Einen wichtigen Beitrag zur Normierung und Definition unterschiedlicher EV-Subtypen leistet die Internationale Gesellschaft für Extrazelluläre Vesikel (engl.: International Society of Extracellular Vesicles). Das Ziel ist es, eine Normierung der verwendeten Methoden im Bereich der Forschung über Extrazelluläre Vesikel zu erreichen. Zu Beginn wurden Extrazellulären Vesikel wenig biologische Bedeutung beigemessen. Die Annahme, dass es sich lediglich um Vesikeln handle, welche Zellen nutzen um sich von überschüssigen Molekülen und Proteinen zu entledigen, wurde aufgrund zahlreicher Forschungen bald widerlegt. Heute steht außer Frage, dass EV in zahlreichen pathologischen und physiologischen Funktionen involviert sind und eine wichtige Rolle in der Zell-Zell- Kommunikation, sowie in der Diagnose und Therapie von zahlreichen Krankheiten spielen. Eine Gemeinsamkeit aller EV ist es, dass sie von einer Lipid-Doppelmembran umgeben sind und an ihrer Oberfläche zahlreiche Signalmoleküle aufweisen, sowie im Inneren, abhängig von ihrer Mutterzelle, eine Vielzahl von Proteinen, Lipiden und Nucleinsäuren tragen. An der molekularen Zusammensetzung der Vesikel wird bis heute intensiv geforscht, da sie darüber entscheidet woher die EV stammen, an welche Zielzelle sie binden und welche Funktionen sie daran ausüben. Spezielle Datenbanken, wie EVpedia oder Vesiclepedia bemühen sich die bislang dokumentierten Proteine, Lipide oder Nucleinsäuren zu dokumentieren. Um eine intensive Forschung an der Funktion und molekularer Zusammensetzung Extrazellulärer Vesikel zu gewährleisten, bedarf es jedoch einer Optimierung und Validierung an bestehenden Isolierungs-, Charakterisierungs-, sowie Quantifizierungsmethoden, welches zugleich das Ziel dieser Arbeit darstellte. Es ist uns gelungen, EV in der Größenordnung zwischen 50 bis 150 nm zu isolieren, zu charakterisieren und deren Anwesenheit anhand geeigneter Methoden zu beweisen. Differentielle Ultra-Zentrifugation wurde als Standardmethode gewählt und Extrazelluläre Vesikel aus humanen, induzierten pluripotenten Stammzellen entlang eines Kultiverungs- und Differenzierungsprozessen zu Kardiomyozyten erfolgreich isoliert. Mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz konnten Zellen entlang des Differenzierungsprozesses charakterisiert, deren Anwesenheit bestätigt und das entsprechende Kulturmedium gewonnen werden. Des Weiteren war es uns möglich, isolierte EV anhand ihrer Größe, Größenverteilung, Konzentration und Ausbeute mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse, kurz NTA, zu charakterisieren. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ermöglichte es uns, deren Morphologie zu bestätigen und Aussage darüber zu treffen, warum eine Isolierung aus ‚frischem‘ Kulturmedium, einem über einen längeren Zeitraum gelagertem Kulturmedium bei -80°C bzw. -20°C, vorzuziehen ist. Um die erhaltenen Vesikel noch besser zu charakterisieren, versuchten wir mittels des Bichinchonsäure-Tests (engli. micro bicinchoninic bcid protein assay (mBCA)), die in Extrazellulären Vesikel enthaltenen Proteine zu quantifizieren, da anhand dessen wichtige Aussagen über Herkunft, Funktion, sowie Art des Extrazellulären Vesikels getroffen werden können. Dieser Bereich, sowie die Identifizierung von EV-Markern (typische Proteine enthalten in EV), wiesen einige Hindernisse auf und konnten wegen Limitierungen in bereits bestehenden Experimenten, sowie Beschränkungen in der zur Verfügung stehenden Zeit nicht ohne Schwierigkeiten durchgeführt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die zellbasierte Funktionalität von EV zu bestimmen. Diese Experimente konnten aber in Bezug auf oben genannten Gründen nicht weiter durchgeführt werden. Nichtsdestotrotz, ist es uns gelungen, ein Protokoll für den Isolierungs- und Charakterisierungsprozess von Extrazellulären Vesikeln zu optimieren, welches in Zukunft für weitere Experimente angewendet werden kann und Extrazelluläre Vesikel anhand dieser Grundlage weiter erforscht werden können. Außerdem wurden während dieser Arbeit eine Reihe an unterschiedlichen Techniken und Methoden, wie z.b Zellkultivierung, differentielle Ultra- Zentrifugation, NTA oder TEM, angewendet, wodurch ein weites Spektrum an Wissen angeeignet werden konnte.
Abstract
(Englisch)
Cardiovascular disease (CVD), a group of diseases which affect the heart and blood vessels, is the number one cause of death worldwide. CVD, or more precisely myocardial infarction (MI), is associated with a massive and irreversible loss of cardiomyocytes. Despite tremendous research effort, there is still a lack of acknowledgment in therapies for cardiac regeneration. Using stem cells for generating cells and tissue that could be used for cell-based-therapies and provide regenerative therapies for ischemic heart disease (IHD), is perhaps the most potential application of stem cells nowadays. Initially, it was estimated that implanted cells could directly replace the damaged tissue, however, it is becoming evident that the factors released by these cells are the main drivers of therapeutic effects. A variety of evidence showed that these factors are released in small lipid-enclosed structures, called extracellular vesicles (EVs). Based on their biogenesis, EVs are divided into three main subtypes: exosomes, microvesicles and apoptotic bodies. Apart from fundamental biological functions and their importance in the pathology of several diseases, EVs are key mediators of intercellular communication in a variety of biological processes and have the ability to recapitulate the efficacy of their parent cell. In spite of the extensive research effort regarding the intrinsic functions of EVs, there is still a lack of standardized methods for EVs isolation, characterization and quantification, which greatly limits our ability to study them. In this study, we isolated and characterized EVs in the size range between 50 to 150 nm, which is referred to as the smallest subpopulation of EVs. We successfully isolated EVs from human induced Pluripotent Stem Cell- derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) along their differentiation and maturation. Exclusively differential ultracentrifugation (dUC) was performed for the isolation process, which is referred to as the golden standard technique. Furthermore, we were able to define a protocol to characterize the EVs regarding size, size distribution, purity, concentration and yield by the use of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), followed by evaluating these results by confirming the presence and morphology of EVs by Transmission Electron Microscopy (TEM). In order to quantify and normalize the amount of EVs in preparations prior to performing further assays, we measured the total protein concentration of EVs with micro bicinchoninic acid (mBCA) Protein Assay Kit, as well as performed marker identification, whereby both of these tasks showed limitations in achieving reproducible results. Nonetheless, a variety of comparable and sufficient results could be obtained, which promise new insights in cell-based therapies and definitely can be used for functional assessments and further purposes to achieve cardiac regeneration.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
cardiovascular disease human induced pluripotent stem cells extracellular vesicles differential ultracentrifugation nanoparticle tracking analysis
Schlagwörter
(Deutsch)
kardiovaskuläre Erkrankungen humane induzierte pluripotente Stammzellen extrazelluläre Vesikel differentielle Ultrazentrifugation Nanopartikel-Tracking Analyse
Autor*innen
Katharina Anna Kasper
Haupttitel (Englisch)
Isolation and characterization of EVs from hiPSC and hiPSC-derived cardiomyocytes
Paralleltitel (Deutsch)
Isolierung und Charakterisierung aus hiPSC und hiPSC-erlangten Kardiomyozyten
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
II, 52 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Franz Gabor
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.30 Naturwissenschaften in Beziehung zu anderen Fachgebieten ,
44 Medizin > 44.03 Methoden und Techniken der Medizin
AC Nummer
AC16341678
Utheses ID
59482
Studienkennzahl
UA | 449 | | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1