Detailansicht
Characterisation of specific antibodies against different subunits of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR)
Rica Schadl
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Petra Scholze
DOI
10.25365/thesis.69851
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-11130.74620.234075-8
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptor (nAChR) ist ein ligandengesteuerterIonenkanal, der aus verschiedenen α- und β--Untereinheiten geformt wird und eineSchlüsselrolle im zentralen sowie peripheren Nervensystem spielt. Die Zusammensetzung derUntereinheiten ist dabei maßgeblich für die biophysikalischen und pharmakologischenEigenschaften des Rezeptors, aber auch mitverantwortlich für verschiedene Pathogenesen.Um einzelne Untereinheiten und deren Zusammensetzung in den Rezeptoren näheruntersuchen zu können, sind untereinheitenspezifische Antikörper ein wichtiges Werkzeug.Diese Antikörper müssen für die gewählten Methoden geeignet sein und daher zuvorausreichend charakterisiert und analysiert werden. In dieser Arbeit wurden nun bereitsetablierte, sowie neu generierte Antikörper auf die Eignung für die Verwendung beizukünftigen Experimenten getestet.Im speziellen fokussiert sich diese Arbeit einerseits auf bereits vorhandene Antikörper gegen die α3, α4, β2 und β4 Untereinheiten, die unter anderem die heteropentameren α3β4 und α4β2 Rezeptoren bilden. Diese wurden in der Vergangenheit bereits zur Analyse derentsprechenden Untereinheiten getestet und verwendet. Da die Antikörper von Kaninchengewonnen wurden, die mit Fusionsproteinen, die DNA-Fragmente der Sequenzen derUntereinheiten der Maus enthalten, immunisiert wurden, wurden diese bisher nur anmurinem Gewebe und transfizierten HEK-293 Zellen eingesetzt. Die Frage, die sich bezüglichdieser Antikörper nun stellte, ist, ob diese auch die humanen Untereinheiten erkennen undfür Methoden zur näheren Erforschung der humanen Rezeptoren geeignet sind.Alle Antikörper wurden im nativen Gewebe von Mäusen (Habenula) und transfizierten HEK293 Zellen mittels Western Blot und ausgewählte Antikörper auch mittelsimmunozytochemischer Färbungen von transfizierten HEK-Zellen analysiert.Der Hauptteil der Arbeit befasst sich aber mit der Charakterisierung von neu generiertenAntikörpern, die gegen den humanen homopentameren α7 Rezeptor gerichtet sind. Dieser Rezeptor ist von besonderem Interesse, da im Laufe der Evolution des Menschen das fürdiesen kodierende Gen CHRNA7 dupliziert wurde und die Duplikate CHRFAM7A undCHRFAM7A∆2bp für die Entstehung diverser Krankheiten wie Schizophrenie, MorbusAlzheimer oder Epilepsie, mitverantwortlich gemacht werden. Diese Antikörper wurdenebenfalls durch zuvor immunisierte Kaninchen produziert und mit Hilfe derselben Methodikcharakterisiert.XIIBezüglich der ersten Frage ergab der Vergleich der DNA-Sequenzen von Mensch und Maus,dass die der α3 und β2 Untereinheiten einen hohen Ähnlichkeitsgrad aufweisen, dieSequenzen der α4 und β4 Untereinheit weisen im Gegensatz dazu größere Unterschiede auf.Daher wurde angenommen, dass die bereits vorhandenen anti-α4 und -β4 Antikörper diehumanen Rezeptoruntereinheiten nicht erkennen werden, während die anderen Antikörpermit hoher Wahrscheinlichkeit zur Detektion beider Proteine verwendet werden könnten.Diese Annahme wurde sowohl im Western Blot als auch für die zwei Antikörper α3S1 und β2S19 in der Immunozytochemie (ICC) bestätigt.Der neu hergestellte α7LS3 Antikörper gab sowohl im Western Blot als auch in der ICCvielversprechende erste Ergebnisse, muss aber noch weiter untersucht werden. Alle anderen Antikörper dieser Generation lieferten im Rahmen dieser Arbeit keine oder nur unspezifischeErgebnisse.
Abstract
(Englisch)
The neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) is a ligand-gated ion channel formed bydifferent α and β subunits and plays a key role in the central and peripheral nervous system.The composition of the subunits is crucial for the biophysical and pharmacological propertiesof the receptor but is also partly responsible for some pathogenesis. Subunit-specificantibodies are an important tool for further investigation of individual subunits and theircomposition in receptors. These antibodies must be suitable for the chosen methods and musttherefore be sufficiently characterised and analysed beforehand. In this work, established aswell as newly generated antibodies were tested for their suitability in future experiments.In particular, this work focuses on the one hand on already existing antibodies against the α3,α4, β2 and β4 subunits, which form the heteropentameric α3β4 and α4β2 receptors, amongothers. These have already been tested and used in the past for the analysis of thecorresponding subunits. Since the antibodies were gained from rabbits immunised with fusionproteins containing DNA fragments of the sequences of mouse subunits, they have so far onlybeen used on murine tissue and transfected HEK-293 cells. The question that has now arisenis whether they recognize the human subunits and are suitable for methods to study humanreceptors as well.All antibodies were analysed in native tissue of mice (habenula) and transfected HEK-293 cellsby Western blot and selected antibodies were further analysed by immunocytochemistry (ICC)with transfected HEK cells.The main part of this work is focused on the characterisation of newly generated antibodiesdirected against the human homopentameric α7 receptor. This receptor is of particularinterest because the gene encoding for it, which is called CHRNA7, has been duplicated duringhuman evolution. These duplicates, named CHRFAM7A and CHRFAM7A∆2bp, are thought tobe partly responsible for various diseases such as schizophrenia, Alzheimer's disease orepilepsy. The antibodies against these receptor subunits were also produced by previouslyimmunised rabbits and characterised using the same methods.Regarding the first question, the comparison of human and mouse DNA sequences showedthat those of the α3 and β2 subunits show a high rate of similarity, whereas the sequences ofthe α4 and β4 subunits show greater differences. Therefore, it was assumed that the existinganti-α4 and -β4 antibodies would not recognize the human receptor subunits, while the ones against the α3 and β2 subunit could most likely be used to detect both, rodent and humanXproteins. This hypothesis was confirmed in western blot as well as for the antibodies α3S1 and β2S19 in ICC.The newly produced α7LS3 antibody gave promising first results in western blot and ICC, butneeds to be further examined. All other antibodies of this generation gave no or onlyunspecific results in this work.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) subunit-specific antibodies CHRFAM7A CHRFAM7A∆2bp immunocytochemistry western blot
Schlagwörter
(Deutsch)
neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptor (nAChR) untereinheitenspezifische Antikörper CHRFAM7A CHRFAM7A∆2bp Immunozytochemie Western Blot
Autor*innen
Rica Schadl
Haupttitel (Englisch)
Characterisation of specific antibodies against different subunits of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR)
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung von spezifischen Antikörpern gegen verschiedene Untereinheiten des neuronalen nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR)
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
65 Seiten $$b Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Petra Scholze
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.30 Naturwissenschaften in Beziehung zu anderen Fachgebieten
AC Nummer
AC16356087
Utheses ID
59493
Studienkennzahl
UA | 449 | | |