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Function of mTORC2 in mitochondria
Lukáš Gulla
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Biologische Chemie
Betreuer*in
Robert Konrat
Mitbetreuer*in
Ivan Yudushkin
DOI
10.25365/thesis.69871
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-11132.81291.591435-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Mechanismen und die Funktionen des mTORC2s sind bis jetzt meistens unbekannt. Es wurde erfolgreich in der Plasmamembran, ER und MAM nachgewiesen, das bedeutet in der Nähe des Mitochondriums.
Um den Effekt und die Rolle des mTORC2s in den mitochondriellen Prozessen haben wir eine mSin1 knockdown Zelllinie charakterisiert. Wir beobachteten reduzierte mSin1 Spiegel in HeLa und HL60, was keinen Einfluss auf die anderen mTORC2 Komponenten mTOR zur Folge hatte. Wir zeigen, dass ein unvollständiges mTORC2 nicht fähig Akt an der Stelle Serin 473 zu phosphorylieren, was zu einer unvollständigen Aktivierung von Akt führt. Dies führt nicht unbedingt zur �nderungen in der Phosphorylierung von Akt-Substrat Gsk3� an Serin 9. Wir beobachteten kein Effekt des reduzierten Akt-pS473 auf die Dephosphorylierung von Akt auf der Stelle Threonin 308. Beide Zelllinien (Kontrol- und Knockdown) zeigen ähnliches Verhalten in Abhängigkeit von der steigenden Serumkonzentration, wobei sie die schnellste Wiederherstellung der Aktivität zwischen 0 und 2% Serumkonzentration zeigten.
Die Isolierung der mitochondriellen Fraktion zeigte niedrige Mengen von mTORC2 Komponenten mSin1 und mTOR im Mitochondrium, aber keine Korrelation zwischen mSin1 und mTOR sowohl in den Kontrol- und Knockdown Zellen.
Wir haben erfolgreich Konstrukte aus mSin1 Isoformen 2,4 und 5 hergestellt, die durch Anhängen des mitochondriellen Membranproteins Bcl-xL zum Mitochondrium gerichtet wurden. Dieses Anhängen führte zur Translokation dieser Konstrukte aus anderen Zellkompartimenten.
Nach der Transfektion der Zellen mit diesen Konstrukten wurde die mitochondrielle Fraktion isoliert, die höhere Mengen an mSin1 im Mitochondrium zeigte.
Für den gleichen Zweck wurde eine mSin1 und mRictor knockout Zelllinie charakterisiert, die das gleiche Verhalten bezüglich der Phosphorylierung der Stelle S473 von Akt zeigte. In dieser Zelllinie blieb die Phosphorylierung von Akt an der Stelle T308 konstant. Die Isolierung der mitochondriellen Fraktion zeigte konstante Mengen an mTOR in den Kontroll-, mRictor und mSin1 knockout Zellen, was die frühere Beobachtung in der mSin1 knockdown Zelllinie bestätigt. Reduzierte mSin1 Menge in mRictor knockout Zellen im Vergleich zu den Kontrollzelle könnte die Existenz einer Abhängigkeit von diesen zwei mTORC2 Komponenten voneinander andeuten.
Abstract
(Englisch)
mTORC2's functions and mechanisms in the cell are mostly unknown. It has been successfully located to the plasma membrane and ER and MAM, so to the close proximity of mitochondria.
To examine the mTORC2's effect on and role in mitochondrial processes we characterized a mSin1 knockdown cell line. We observed reduced mSin1 levels in HeLa and HL60, which didn't have an effect on other mTORC2 component mTOR.
We show, that a uncomplete mTORC2 is not able to phosphorylate Akt on serine 473, which is therefore not fully active. This doesn't necessarily lead to differences in phosphorylation of its substrate Gsk3� on serine 9. We didn't observe an effect of reduced Akt-pS473 on dephosphorylation of Akt on threonine. Both cell lines (control and knockdown) behave similarly in response to the increasing serum concentration, showing the fastest restoration of activity at around between 0 and 2% serum concentration.
The isolation of the mitochondrial fraction showed low levels of mTORC2 components mSin1 and mTOR in mitochondria, but no correlation between mSin1 and mTOR in control or mSin1 depleted cells.
We successfully created constructs of mSin1 isoforms 2,4 and 5, targeted to mitochondria, by fusing mitochondrial membrane protein Bcl-xL to them. This fusion indeed resulted in mitochondrial localization of these constructs, which were localized to other cellular compartments before.
The transfection of the cells with these constructs followed by the isolation of mitochondrial fraction showed an increased mSin1 presence in the mitochondrial fraction.
For the same purpose we characterized a mSin1 and mRictor knockout HL60 cell line, which led to the same observation on phosphorylation of Akt on position S473. Here the T308 phosphorylation levels remained constant or with very small changes. The mitochondrial isolation in this cell line showed constant levels of mTOR in control, mRictor and mSin1 knockout cells, confirming the observation in the mSin1 knockdown cell line. Reduced mSin1 levels in mRictor knockout cell line, when compared to the control cell line, could suggest a possible dependence of these two mTORC2 components on each other.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
mTORC2 mSin1 knockdown mSin1 knockout mTOR Akt S473 Akt T308 mitochondria
Schlagwörter
(Deutsch)
mTORC2 mSin1 knockdown mSin1 knockout mTOR Akt S473 Akt T308 Mitochondrium
Autor*innen
Lukáš Gulla
Haupttitel (Englisch)
Function of mTORC2 in mitochondria
Paralleltitel (Deutsch)
Funktion von mTORC2 im Mitochondrium
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
83 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Robert Konrat
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,
35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,
35 Chemie > 35.71 Biochemische Methoden ,
42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Nummer
AC16378450
Utheses ID
59526
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |