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Enzymatic cascades in Escherichia Coli based on the equilibration of reactive Aldehyde intermediates
Lydia Suchy
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Genetik und Entwicklungsbiologie
Betreuer*in
Florian Rudroff
DOI
10.25365/thesis.69963
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-11145.22570.416757-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Synthetische Enzymkaskaden in lebenden Zellen bieten eine bedeutende Möglichkeit zur Herstellung wertvoller Chemikalien. Dabei stellen Aldehyde wichtige Zwischen- und Vorstufen für zahlreiche chemische Verbindungen dar. Hochreaktive Aldehydspezies sind jedoch für den Organismus toxisch. Mechanismen in der Wirtszelle kompensieren die Zelltoxizität, indem unerwünschte Nebenprodukte (die entsprechenden Alkohole und Carbonsäuren) durch endogene Enzymaktivitäten gebildet werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass in ruhenden E. coli-Zellen primäre Alkohole und Carbonsäuren durch eine Alkoholdehydrogenase (AlkJ, P. putida) bzw. Carbonsäurereduktase (CARNi, N. iowensis) in Aldehyde umgewandelt werden können. Dadurch wird der Kohlenstofffluss von den Nebenprodukten zum Aldehyd-Zwischenprodukt umgeleitet, was zu einem Gleichgewicht zwischen Alkoholen, Aldehyden und Carbonsäuren führt. Gleichzeitig steht der Aldehyd für die weitere Umsetzung frei zur Verfügung. Bisher wurde Aldolase (Fsa1-A129S, E. coli) als einziges Enzym mit diesem biokatalytischen Gleichgewicht kombiniert. Um das Spektrum dieses Konzepts zu erweitern und seine Anwendbarkeit für die Synthese verschiedener Verbindungen nachzuweisen, wurden anstelle der Aldolase neue Enzymklassen in die Kaskade eingebaut: Pyruvat-Decarboxylase (PDCAp_mutant, A. pasteurianus), ⍵-Transaminase (VflH6, V. fluvialis) und Imin-Reduktase (PIR23, C. ferrugineus). Für die Co-expression aller Enzyme wurde ein Zwei-Plasmid-Ansatz verwendet. Dafür wurden die entsprechenden Gene in das Plasmid, welches das Gen alkj enthielt, subkloniert und mit dem Plasmid, welches das Gen carNi enthielt, in E. coli co-transformiert. Nach Bestätigung der erfolgreichen Co-produktion aller Enzyme, wurden die drei neuen biokatalytische Kaskaden getestet. Auf diese Weise wurde das biokatalytische Konzept erfolgreich auf die Produktion von α-Hydroxyketonen, primären und sekundären Aminen erweitert.
Abstract
(Englisch)
Synthetic enzyme cascades in living cells offer a great possibility for the production of valuable chemicals. Hereby, aldehydes represent important intermediates and precursors for numerous chemical compounds. However, highly reactive aldehyde species are toxic to the organism. Host cell responses compensate for cellular toxicity forming undesired byproducts (the respective alcohols and carboxylic acids) by endogenous enzyme activities. Previous research has shown that the carbon flux can be redirected from the byproducts to the target aldehyde intermediate by the enzymes alcohol dehydrogenase (AlkJ, P. putida) and carboxylic acid reductase (CARNi, N. iowensis), leading to an equilibration between alcohols, aldehydes, and carboxylic acids in E. coli resting cells. At the same time, the aldehyde is freely available for further reaction. So far, aldolase (Fsa1-A129S, E. coli) has been the only enzyme applied in combination with this biocatalytic equilibrium. To expand this concept and prove that it can be applied to synthesise a wide range of compounds, new enzyme classes were incorporated into the cascade in place of the aldolase: pyruvate decarboxylase (PDCAp_mutant, A. pasteurianus), ⍵-transaminases (VflH6, V. fluvialis) and imine reductase (PIR23, C. ferrugineus). A two-plasmid approach was used for the co-expression of all enzymes. Therefore, the respective genes were subcloned into the plasmid containing the gene alkj and co-transformed with the plasmid harbouring carNi in E. coli. After confirmation of successful co-production of all enzymes, the three new biocatalytic pathways were tested. In this way, the biocatalytic concept was expanded successfully to yield α-hydroxy ketones, primary and secondary amines.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
biocatalysis enzymatic cascade reactions whole-cell biocatalysis in vivo biotransformations Escherichia coli reactive aldehydes
Schlagwörter
(Deutsch)
Biokatalyse enzymatische Kaskadenreaktionen Ganzzellbiokatalyse in vivo Biotransformationen Escherichia Coli reaktive Aldehyde
Autor*innen
Lydia Suchy
Haupttitel (Englisch)
Enzymatic cascades in Escherichia Coli based on the equilibration of reactive Aldehyde intermediates
Paralleltitel (Deutsch)
Enzymatische Kaskaden in Escherichia Coli basierend auf der Äquilibrierung reaktiver Aldehyd Spezies
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
111 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Florian Rudroff
AC Nummer
AC16264816
Utheses ID
59683
Studienkennzahl
UA | 066 | 877 | |