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Characterization of the potential metabolite binding pocket of RapZ and the interaction of RapZ with EINtr in Escherichia coli

Lara Lucija Paparic

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie

Betreuer*in

Boris Görke

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DOI

10.25365/thesis.70107

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-11163.87801.267070-8

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Aminozucker sind integrale Bausteine der bakteriellen Zellhülle. Der Aminozucker Syntheseweg beginnt mit der Katalyse von Glucosamine-6-phosphat (GlcN6P), durch das Enzym GlcN6P-Synthase (GlmS). GlmS wird auf verschiedenen Ebenen streng kontrolliert. In Escherichia coli, beteiligen sich zwei kleine RNAs (sRNAs), GlmY und GlmZ, und das RNA-Bindungsprotein RapZ an der translationalen Regulation von GlmS. GlmZ bindet die glmS-mRNA und ermöglicht die Translation des Proteins. RapZ reguliert dies, indem es GlmZ zum Abbau durch RNase E rekrutiert, während GlmY RapZ daran hindert. Das regulatorische Netzwerk wird von der Verfügbarkeit von GlcN6P beeinflusst, welche durch RapZ wahrgenommen wird. Die Struktur von RapZ zeigt eine mögliche Bindetasche für Liganden, die für die Bindung und Wahrnehmung von GlcN6P verantwortlich sein könnte. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde diese potenzielle Metaboliten-Bindetasche untersucht. Zu diesem Zweck wurden sechs Aminosäurereste in der Tasche mutiert und die Mutanten auf verschiedene Funktionen hin getestet. Zusätzlich wurde eine Methode zum „Photo-Crosslinking“ etabliert und angewendet, um die direkte Interaktion dieser 6 Aminosäuren mit relevanten anderen Proteinen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Tasche an verschiedenen Funktionen des Proteins beteiligt ist: von der RNA-Bindung bis zur Aktivierung des QseE/QseF Zwei-Komponentensystems. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Beziehung zwischen RapZ und PTSNtr untersucht. PTSNtr ist ein Phosphortransferase-System, das verschiedene Stoffwechselwege in Gram-negativen Bakterien beeinflusst. Unter anderem ist es an der Regulation des Zellhüllstresses beteiligt, und zwei der involvierten Proteine sind im selben Operon wie RapZ kodiert. Frühere Experimente haben gezeigt, dass RapZ mit PtsP, einem Enzym dieses Systems, interagieren könnte. Daher wurde die Interaktion zwischen RapZ und PtsP eingehender erforscht, wobei sich die Bindung der beiden Proteine als instabil erwies. Zusätzlich, ergab es sich dass PtsP die glmS-Translation beeinflussen könnte, jedoch unabhängig von RapZ.

Abstract

(Englisch)

Amino sugars are important building blocks of the bacterial cell envelope. GlcN6P, the first amino sugar in the synthesis pathway, is synthesized by the enzyme GlcN6P synthase (GlmS). GlmS is tightly controlled on different levels. In Escherichia coli, the translation of glmS transcript is regulated by a complex feedback circuit, which involves two small RNAs, GlmY and GlmZ and the RNA binding protein RapZ. GlmZ base pairs with glmS mRNA to enable the translation of glmS. RapZ regulates this, by recruiting GlmZ for cleavage, while GlmY counters this. The entire circuit is dependent on GlcN6P availability, which is sensed by RapZ. The RapZ structure has revealed a ligand binding pocket, which could be responsible for GlcN6P binding and sensing. In the first part of this work, the potential metabolite binding pocket was investigated. To this end, six amino acids surrounding the pocket were substituted and the corresponding RapZ variants were tested for various features. In addition, a crosslinking method was used to determine direct interaction of the 6 amino acids with other proteins. The results showed that the pocket is involved in several different functions of the protein: from RNA binding, to activation of the QseE/QseF two component system. In the second part of this work, the relationship between RapZ and the PTSNtr was investigated. PTSNtr is a phosphotransferase system, which regulates various pathways in gram negative bacteria. Among many other roles, it is involved in cell envelope stress regulation and two of its proteins are encoded within the same operon as RapZ. Previous experiments have shown that RapZ might interact with PtsP, an enzyme of this system. Therefore, the interaction between RapZ and PtsP was tested more thoroughly and it showed to be unstable. In addition, it was found that that PtsP might influence glmS translation, however independently of RapZ.

Autor*innen

Lara Lucija Paparic

Haupttitel (Englisch)

Characterization of the potential metabolite binding pocket of RapZ and the interaction of RapZ with EINtr in Escherichia coli

Paralleltitel (Deutsch)

Charakterisierung der potentiellen Metaboliten-Bindungstasche von RapZ und die Interaktion von RapZ mit EINtr in Escherichia coli

Publikationsjahr

2021

Umfangsangabe

125 Seiten : Illustrationen

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Boris Görke

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC16460863

Utheses ID

59939

Studienkennzahl

UA | 066 | 830 | |

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Schlagwörter