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Drug resistance and virulence of the human fungal pathogen Candida glabrata
Tobias Schwarzmüller
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Karl Kuchler
DOI
10.25365/thesis.6656
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29131.41478.956453-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Candida glabrata ist ein opportunistischer humanpathogener Pilz. Nach Candida
albicans stellt er die zweithäufigste Ursache für Pilzerkrankungen durch Candida spp. dar.
Die Infektion mit C. glabrata kann zu Erkrankungen der Haut oder der Schleimhäute bis hin
zur lebensbedrohlichen systemischen Infektion bei immunsupprimierten Patienten führen.
Hauptvirulenzfaktoren von C. glabrata sind sowohl eine erhöhte natürliche Resistenz gegen
Azolverbindungen, als auch eine große Anzahl verschiedener Adhesine. Welche
molekularen Mechanismen diesen Virulenzfaktoren zu Grunde liegen, ist größtenteils noch
unbekannt.
Genomik und phänotypische Analyse von Deletionsmutanten stellen einen Ansatz
dar, um neue Virulenzfaktoren pathogener Pilzen zu identifizieren. Für diese Doktorarbeit
wurden C. glabrata Sequenzdaten verwendet, um nicht essentielle, zu Saccharomyces
cerevisiae homologe Gene auszuwählen. Mit Hilfe eines revers-genetischen Ansatzes wurde
dann eine Kollektion von Deletionsmutanten erstellt. Diese Stammbibliothek diente als
Ausgangsbasis für die phänotypische Analyse der Mutanten zur Identifizierung neuer Gene,
die die Pathogenität und Azolresistenz von C. glabrata beeinflussen. Insgesamt umfasst die
Kollektion 476 einzelne, mit einem molekularen Barcode versehene Stämme, bei denen
Signaltransduktionsgene, Transkriptionsfaktoren, Zellwandbiosynthesegene, Resistenzgene
und C. glabrata spezifische Gene deletiert wurden. Es wurden 103 Mutanten identifiziert, die
Wachstumsdefekte unter Zellwandstress, in Gegenwart von Antimykotika, bei
Temperaturstress, Osmolaritätsänderungen, Kontakt mit Detergenzien oder beim Wachstum
auf Minimalmedium aufzeigen.
Die Interaktion zwischen Makrophagen und C. glabrata wurde in vitro durch die
Detektion von reaktiven Sauerstoffmolekülen (ROS) getestet. Dadurch wurden mehrere
Zellwandmutanten entdeckt, die eine erhöhte ROS-Produktion durch die Makrophagen
verursachen.
Mehrere Deletionsstämme zeigten Phänotypen, die sich von den bekannten S.
cerevisiae Mutanten unterscheiden. Es konnten Gene identifiziert werden, die noch nicht mit
Caspofunginsensitivität assoziiert worden sind. Darunter befanden sich auch Gene, die keine
Orthologe in S. cerevisiae haben.
CgCBK1 wurde aufgrund des schweren Zellteilungsdefekts näher charakterisiert. Die
Transkriptionsanalyse des Cgcbk1Δ Stammes zeigte, dass bestimmte Zellwandgene
unterschiedlich exprimiert werden.
Diese Sammlung von Deletionsstämmen ist eine der größten weltweit und ist somit
von sehr großem Nutzen für das Studium der Pathogenität von C. glabrata. Zukünftige in
vivo Experimente werden unter Ausnützung der integrierten „molekularen Barcodes“ die
Identifizierung neuer Virulenzfaktoren ermöglichen.
Abstract
(Englisch)
Candida glabrata is an opportunistic human fungal pathogen. It is the second most
frequent cause of Candida-derived infections after Candida albicans. Infection with either one
of the two pathogenic fungi can result in diseases ranging from superficial cutaneous or
mucosal to life-threatening systemic infections in immunocompromised individuals. Welldocumented
virulence attributes of C. glabrata are the inherent reduced azole susceptibility
and a large repertoire of adhesin genes, which are regulated by transcriptional silencing.
However, the molecular basis of C. glabrata antifungal drug resistance and additional
virulence factors is not well understood.
The combination of fungal genomics and large-scale phenotypic profiling of deletion
mutants represents a powerful approach to identify new factors contributing to fungal
virulence. For this doctoral thesis, the C. glabrata genome sequence data were used to
select genes with non-essential functional orthologues of the non-pathogenic yeast
Saccharomyces cerevisiae. Based on this selection, a large-scale reverse genetics approach
was initiated to identify novel genes implicated in C. glabrata pathogenicity and drug
resistance. A bar-coded C. glabrata deletion strain collection was engineered comprising
some 500 single gene deletion mutants affected in signaling functions, regulation of gene
expression, cell wall biogenesis, transport processes, drug resistance, stress response and
metabolism. Phenotypic profiling identified a total of 103 C. glabrata genes involved in
resistance to cell wall-perturbing compounds, antifungal drugs, heat stress, osmosensitivity,
metal ion or detergent tolerance, growth on minimal medium and phenotypic switching.
Host-pathogen interaction related phenotypes were analyzed using an in vitro assay
detecting reactive oxygen species (ROS). Screening for ROS elicited by primary mouse
bone-marrow-derived macrophages co-incubated with C. glabrata mutants resulted in the
identification of mutants lacking cell wall-related genes.
Taken together, numerous deletion strains showed growth phenotypes different from
known phenotypes of S. cerevisiae. For example, genes were identified, which have
previously not been associated with sensitivity to the glucan synthase inhibitor Caspofungin.
This also included C. glabrata genes, which do not have orthologues in baker’s yeast.
The function of CgCBK1 gene has been studied in more detail, because it exhibits
severe cell separation defects. Transcriptional profiling of this mutant showed differential
expression of a distinct set of genes with cell wall-associated functions.
In summary, the generated C. glabrata gene deletion strain collection is one of the
largest collections of fungal deletion strains in the world and represents a powerful tool to
study the virulence of a human fungal pathogen. Future studies based on the in vitro results
will exploit the signature-tag strategy to identify novel virulence-associated factors in vivo.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Candida glabrata drug resistence virulence gene deletion strain library drug screening host pathogen interaction molecular barcode fusion PCR
Schlagwörter
(Deutsch)
Candida glabrata Resistenz Virulenz Erstellung einer Bibliothek von Gendeletionsstämmen Screening Wirt-Pathogen Interaktion molekularer Barcode fusion PCR
Autor*innen
Tobias Schwarzmüller
Haupttitel (Englisch)
Drug resistance and virulence of the human fungal pathogen Candida glabrata
Paralleltitel (Deutsch)
Resistenz und Virulenz der humanpathogenen Hefe Candida glabrata
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
197 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Michael Weig ,
Piet de Groot
AC Nummer
AC07452203
Utheses ID
6000
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |