Detailansicht

Cloning and heterologous expression of cryptic biosynthetic gene clusters from actinomycete bacterium Actinoalloteichus fjordicus
Stefanie Schalko
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Sergey B. Zotchev
Mitbetreuer*in
Olha Schneider
Volltext herunterladen
Volltext in Browser öffnen
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.70193
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-11177.61345.200186-9
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Seit tausenden Jahren werden Sekundärmetabolite, welche von Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren produziert werden, als Heilmittel verwendet. Bis heute sind sie die wichtigste Quelle moderner Arzneimittelzubereitungen. Die Mehrheit an Bakterien- produzierten Medikamenten, insbesondere mit antibiotischen Eigenschaften, wird von der Familie der Actinomyceten produziert. Aufgrund der steigenden Häufigkeit an Infektionen mit multi-resistenten Mikroorganismen, steigt die Notwendigkeit der Entdeckung neuer Arzneistoffe umso mehr. Aus diesem Grund, wurde in diesem Projekt das sogenannte „Genome mining“ mit der DNA des Organismus Actinoalloteichus fjordicus DSM 46856 angewendet, mit dem Ziel, neue bioaktive Substanzen mit antibiotischer Aktivität zu finden. „Genome mining“ beruht auf der Analyse von bakteriallen Genomen, in Kombination mit dem Onlinetool antiSMASH, welches biosynthetische Gencluster indentifizieren kann, die für die Synthese neuer Arzneimittel verantworlich sind. Ziel dieser Arbeit war es eine genomische Library von dem Bakterium Actinoalloteichus fjordicus zu konstruieren, wessen Genom unter anderem zwei vielversprechende biosynthetische Gencluster besitzt. Anschließend wurde mit Hilfe von pooled-PCR die fertige genomische Library gescreent, wodurch E.coli Klone mit den gewünschten biosynthetischen Genclustern gefunden wurden. Durch homologe Rekombination in Hefe wurden diese Fragmente mit dem „Shuttlevector“ pCLY10 eingebaut, wodurch die beiden Gencluster produziert wurden. Als der Zusammenbau erfolgreich war, wurde eine heterologe Expression in drei verschiedenen Wirtsorganismen durchgeführt. Dabei wurden Streptomyces albus B4, Streptomyces albus J1074 und Streptomyces coelicolor M1154 verwendet. Die daraus gewonnenen Extrakte wurden mittels HPLC-Analyse und Bioaktivitätstest analysiert. Resultate dieser Analysen haben im Vergleich zu den Kontrollextrakten keine Ergebnisse gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine weitere Manipulation der klonierten BGCs erforderlich ist, um ihre funktionelle Expression zu erreichen, was in zukünftigen Arbeiten realisiert wird.
Abstract
(Englisch)
Since many years natural products (NPs) of plant, microbial or animal origin have been used as therapeutic agents to treat numerous human diseases. Even until today they remain the most important source of modern drugs. The majority of bacteria-derived NPs, especially with antibiotic properties, were isolated from actinomycete bacteria. Increasing frequency of infection caused by multi-drug resistant microorganisms highlights the importance of discovery of novel NPs with antibiotic activity. For this reason, the focus of this project was “genome minig” of the actinobacterial strain Actinoalloteichus fjordicus DSM 46856 with the purpose of discovering new NPs potentially having antibiotic activity. “Genome mining” relies on the analysis of bacterial genomes with the bioinformatic online tool, antiSMASH, that can identify biosynthetic gene clusters (BGCs) that may govern biosynthesis of novel NPs. The aim of this work was the construction of a genome library of marine sponge-derived actinomycete bacterium Actinoalloteichus fjordicus, which genome harboured two BGCs potentially specifying novel bioactive NPs. Subsequently, the completed library was screened via pooled-PCR to detect library clones with the parts of the BGCs of interest. These parts were assembled into complete BGCs on the modified shuttle vector pCLY10 using transformation-associated recombination in yeast. The assembled BGCs were introduced into three different host organisms: Streptomyces albus B4, Streptomyces albus J1074 and Streptomyces coelicolor M1154 for heterologous expression. The extracts produced from the recombinant strains carrying assembled BGCs were analyzed with HPLC and disc diffusion assays. No differential HPLC peaks nor bioactivity against test organisms used in this work could be observed. These results suggest that further manipulation of the cloned BGCs is required to achieve their functional expression, which will be pursued in a follow-up work.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Biotechnology antibiotics bacteria homologous recombination heterologous expression streptomyces
Schlagwörter
(Deutsch)
Biotechnologie Antibiotika Bakterien homologe Rekombination heterologe Expression Streptomyceten
Autor*innen
Stefanie Schalko
Haupttitel (Englisch)
Cloning and heterologous expression of cryptic biosynthetic gene clusters from actinomycete bacterium Actinoalloteichus fjordicus
Paralleltitel (Deutsch)
Über die Klonierung und die heterologe Expression von kryptischen biosynthetischen Genclustern des Actinomyceten-Bakteriums Actinoalloteichus fjordicus
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
IV, 74 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Sergey B. Zotchev
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC16464408
Utheses ID
60120
Studienkennzahl
UA | 449 | | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1