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Establishment of a molecular networking approach and its application on a fruit extract of Azadirachta indica

Sigrid Adelsberger

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Judith Maria Rollinger

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DOI

10.25365/thesis.70342

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-11194.89855.413339-4

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Diese Diplomarbeit beschreibt die Erstellung und Anwendung der analytischen Methode Molecular Networking (MN) am Department für Pharmazeutische Wissenschaften an der Universität Wien, Abteilung für Pharmakognosie. Im ersten Teil wird ein Handbuch über MN erstellt, ähnlich einem standard operating procedure (SOP) Protokoll, das von zukünftigen AnwenderInnen herangezogen werden kann. Im zweiten Teil wird anhand von verfügbaren UHPLC-HRMS/MS Daten von methanolischen Extraktfraktionen von Azadirachta indica gezeigt, wie man MN in der Praxis anwenden kann. Die klassische Methode der Bioassay-gesteuerten Fraktionierung wird angewendet, um biologisch aktive Komponenten in einem Extrakt durch Anwendung von Zyklen chromatographischer Auftrennung in Kombination mit anschließenden Messungen der Bioaktivität zu isolieren. Nur diejenigen Fraktionen, die eine entsprechende Aktivität gezeigt haben, werden erneut der Fraktionierung und Bioaktivitätsprüfung zugeführt. Diese Methode ist zeit- und arbeitsaufwendig, kostspielig und ressourcenintensiv. Die Anwendung von MN auf die vorliegenden Fraktionen von A. indica stellt einen Ansatz dar, um bioaktive Komponenten unter Verwendung einer bioinformatischen Methode zu finden, ohne dass aufwendige Zyklen bioaktivitätsgesteuerter Fraktionierung durchgeführt werden müssen. Das Handbuch beginnt mit einer Erörterung des Begriffs MN und seiner Basiskonzepte. Die Berechnung von molekularen Netzwerken beruht auf der Kalkulation der Ähnlichkeiten von MS/MS Spektren, dem „spectral alignment“. Dazu werden für die MS/MS Daten sogenannte „cosine scores“ berechnet, die eine mathematische Beschreibung dieser Ähnlichkeiten erlauben. Die open source Plattform GNPS (Global Natural Product Social Molecular Networking) bietet eine ganze Reihe von hilfreichen Anwendungsmöglichkeiten im Bereich von MN und wird kurz vorgestellt. Weiters werden in diesem Handbuch mit Classical Molecular Networking (CMN) und Feature-based Molecular Networking (FBMN) verschiedene Arten von MN beschrieben. CMN ist eine Methode, um aus (beinahe) unbearbeiteten MS/MS Rohdaten Molekulare Netzwerke generieren zu können. FBMN hingegen wird für Datensätze herangezogen, die zuvor ein preprocessing durchlaufen haben. Das Handbuch erklärt, wie man die beiden unterschiedlichen Methoden mittels der auf GNPS bereitgestellten Programme durchführen kann und welche Parametereinstellungen zu beachten sind. Mit MZmine 2 wird in dieser Diplomarbeit auch ein Werkzeug vorgestellt, das man zur Vorbereitung der Daten vor einem FBMN Prozess heranziehen kann. Es bietet dazu eine Vielzahl von Möglichkeiten, wobei hier nur ein ausgewählter Arbeitsaublauf vorgestellt werden soll. Die in GNPS enthaltenen Visualisierungstools sind nicht dazu geeignet, ganze Molekulare Netzwerke auf einmal anschaulich darstellen zu können. Daher wird hier auch die frei zugängliche Software Cytoscape besprochen. Diese kann selbst keine Molekularen Netzwerke erstellen, ermöglicht es jedoch, bestehende ganze Netzwerke graphisch zu bearbeiten und ihnen das gewünschte Erscheinungsbild zu verleihen. Im zweiten Teil dieser Arbeit werden vorhandene MS/MS-Daten aus Fraktionen eines methanolischen Extrakts aus A. indica verwendet, um mithilfe von MN verschiedene Molekulare Netzwerke aufzubauen, um bioaktive Verbindungen mit der Fähigkeit zur Hemmung der Osteoklastendifferenzierung aufzuspüren. Dazu konnten sowohl Bioaktivitätsdaten als auch Datenpakete aus einem sogenannten ELINA approach (Abkürzung für Eliciting Nature`s Activities approach) verwendet werden. Diese ELINA Datenpakete basieren auf NMR-, LC-HRMS- und Bioaktivitätsdaten und machen chemische Merkmale zugänglich, d.h. Strukturen, die bestimmte Trends in den Daten zeigen. Eines dieser Pakete (bestehend aus den Fraktionen 13, 14 und 15) diente als Ausgangspunkt für die Generierung Molekularer Netzwerke und zur Sondierung und Dokumentation verschiedener Datenverarbeitungsszenarien. Zu Beginn wurden FBMN Experimente durchgeführt, da diese MN Methode der einfachste Weg ist, ein Molekulares Netzwerk mit einer reduzierten Anzahl chemischer Merkmale aufzubauen. Bestimmte Vorinformationen können in die FBMN Algorithmen eingespeist und somit bestimmte Daten (vom Benutzer als nicht wichtig definiert) von vornherein ausgeschlossen werden. Eine Reihe von FBMN Parametern wurde variiert und die erhaltenen Ergebnisse verglichen. Der nächste Schritt war die Erstellung Molekularer Netzwerke mit CMN, einer MN Methode, die (fast) keine Datenvorverarbeitung und vorherige Datenmanipulation beinhaltet und daher eine Vielzahl chemischer Merkmale in ein Molekulares Netzwerk einbeziehen kann. Auch hier wurden verschiedene Parameter variiert und die Ergebnisse verglichen und diskutiert. Zusätzlich wurden Quantifizierungsdaten in Form von vorhandenen Peakflächen in die Netzwerke eingespielt. Die Ergebnisse aus all diesen Versuchen werden dann dazu herangezogen, MN für weitere Datensätze (bestehend aus den Fraktionen 1, 2, 3 und 4) zu erstellen, unter Beachtung der zuvor evaluierten und ausgewählten Parameter. Der zweite Teil schließt mit einer Suche nach interessanten chemischen Strukturen ab, die sich durch den Vergleich der molekularen Vernetzung und den Trends aus dem ELINA approach ergeben. Es werden hier solche Teile der molekularen Netzwerke gesucht und graphisch aufbereitet, die eine Übereinstimmung zwischen dem Bioaktivitätstrend und den Peakflächen der verschiedenen Fraktionen aufweisen. Die relevantesten m/z Werte wurden mittels einer Scifinder Datenbanksuche einer Dereplikation unterzogen. Damit liefert diese Diplomarbeit einerseits als Handbuch einen Einstieg in das Thema MN mit Erläuterungen zu Grundlagen und Basiskonzepten. Andererseits macht diese Arbeit deutlich, welche Parameter im Rahmen der Erstellung von MN aus vorhandenen MS/MS Daten von methanolischen Extraktfraktionen von A. indica variiert und evaluiert werden konnten. Sie bietet außerdem graphisch anschauliche Vergleiche zwischen den einzelnen Versuchen, indem Netzwerke einander direkt gegenüber gestellt werden und erörtert, wie die Suche nach chemisch interessanten Strukturen durch MN verbessert werden kann.

Abstract

(Englisch)

This diploma thesis reports on the establishment and application of a molecular networks analysis at the Division of Pharmacognosy, Department of Pharmaceutical Sciences, University of Vienna. In the first part a user guide on Molecular Networking (MN), similar to a standard operating procedure protocol, has been established to be used by future investigators. In the second part, MN is applied on UHPLC-HRMS/MS data derived from fractions of a methanolic fruit extract from Azadirachta indica. The classical method of bioassay guided fractionation is applied to isolate biologically active components in an extract by cycles of chromatographic fractionation combined with subsequent bioactivity measurements. Only those fractions, which have shown a corresponding activity, are again fed to fractionation and bioactivity testing. This process is repeated until the pure bioactive substances have been isolated. This method takes a lot of time and effort, is costly and consumes resources. The application of MN to the present extracts of A. indica represents an approach to find bioactive components using a bioinformatical method, without the need to perform long cycles of bioactivity guided fractionation. The user guide begins with a discussion of the term MN and its basic concepts. The computation of molecular networks is based on the calculation of the similarities of MS/MS spectra, the "spectral alignment". For this purpose, so-called “cosine scores” are calculated for the MS/MS data, which allow a mathematical description of these similarities. The open source platform GNPS (Global Natural Product Social Molecular Networking) offers a whole range of helpful applications in the field of MN and is briefly presented. This manual also describes various types of MN: Classical Molecular Networking (CMN) and Feature-based Molecular Networking (FBMN). CMN is a method to generate molecular networks from (almost) unprocessed, raw MS/MS data. FBMN is used for data sets that have previously been preprocessed. The manual explains how the two different methods can be carried out using the programs provided on GNPS and which parameter settings must be taken into account. The tool MZmine 2, also presented in this thesis, can be used to prepare the data for FBMN. It offers a multitude of possibilities for data preprocessing, whereby a selected work flow is presented here. The visualization tools contained in GNPS are not suitable to display entire molecular networks at once. Therefore the freely accessible software Cytoscape is introduced and discussed here. Cytoscape can not create molecular networks by itself, but allows graphical editing of existing entire networks to create desired designs. In the second part of this thesis, existing MS/MS data from fractions of a methanolic extract from A. indica were used to create different molecular networks with MN in order to search for bioactive compounds with the ability to inhibit osteoclast differentiation. Therefore, both bioactivity data and data packages from a so-called ELINA approach (abbreviation for Eliciting Nature's Activities approach) could be used. These ELINA data packages are based on NMR, LC-HRMS and bioactivity data and make chemical features accessible, i.e. structures that show certain trends in the data. One of these packages (consisting of fractions 13, 14 and 15) served as a starting point for the generation of molecular networks and was used to probe and document various data processing scenarios. First FBMN experiments were carried out because this MN method is the easiest way to create a molecular network with a reduced number of chemical features. Further information can be fed into the FBMN algorithms and other data (defined by the user as not important) can be excluded from the start. A number of FBMN parameters were varied and the obtained results were compared. The next step was the creation of MN with CMN, a MN method that contains (almost) no data preprocessing and previous data manipulation, and thus can include a large number of chemical features in a MN. Also in this step, various parameters were varied and the results compared. In addition, quantification data were fed into the networks in form of measured peak areas. The results from all these experiments were then used to create MN for the application on further data sets (consisting of fractions 1–4), taking into account the previously selected parameters. Out of these data, characteristic chemical structures that resulted from the comparison of the MN with the trends from the ELINA approach were identified and graphically processed. Relevant m/z values were subjected to dereplication using Scifinder. In sum, this diploma thesis shall provide a user guide into the topic of MN with explanations of basic concepts. Applied on MS/MS data obtained from bioactive fractions of a methanolic fruit extract from A. indica, this work shows, which parameters were varied and evaluated in the context for the generation of MN. By means of graphical comparisons between the individual experiments the best settings for the investigated fractions were selected in the search for chemical structures, which are endowed with bioactivities.

Autor*innen

Sigrid Adelsberger

Haupttitel (Englisch)

Establishment of a molecular networking approach and its application on a fruit extract of Azadirachta indica

Paralleltitel (Deutsch)

Etablierung eines Molecular Networking Ansatzes und dessen Anwendung auf einen Fruchtextrakt von Azadirachta indica

Publikationsjahr

2021

Umfangsangabe

x, 275 Seiten : Illustrationen

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Judith Maria Rollinger

Klassifikationen

44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika ,

44 Medizin > 44.41 Pharmazeutische Biologie

AC Nummer

AC16471232

Utheses ID

60328

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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Schlagwörter