Detailansicht
Isolation and characterization of bioactive constituents from Pterocarpus santalinus affecting the healthspan of Caenorhabditis elegans
Karina Ptak
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Judith M. Rollinger
DOI
10.25365/thesis.76452
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-24025.07690.656367-3
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Seit Anbeginn der Zeit ist es eine zentrale Frage der Menschheitsgeschichte, den Alterungsprozess zu verstehen. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans (C. elegans) stellt seit Jahrzehnten einen der wichtigsten Modellorganismen für die Altersforschung dar. Diese Diplomarbeit widmet sich Pterocarpus santalinus L.f., allgemein auch bekannt als Rotes Sandelholz. Der durch Methanol-Dichlormethan gewonnene Kernholzextrakt zeigt einerseits eine vielversprechende lebensverlängernde Wirkung auf Nematoden, und ist andererseits noch unzureichend phytochemsich untersucht. Die folgende Arbeit lässt sich thematisch in zwei Abschnitte gliedern: (i) Isolierung und Charakterisierung von C. elegans lebensverlängernden Bestandteilen aus P. santalinus und (ii) dem phänotypischen Screening ausgewählter Proben, welche die Lebensspanne der Nematoden positiv beeinflussen.
In einer vorausgehenden Studie wurde das Kernholz mittels Extraktion mit Methanol und Dichlormethan im Großmaßstab durchgeführt (i.e. PtesanXDM). Aus dem gewonnenen Rohextrakt wurden anschließend durch Hochleistungs-Gegenstromchromatographie (HPCCC) 13 Fraktionen generiert (PS01_01 – PS01_13), die in einem C. elegans Lifespan-Assay eine signifikante Aktivität auf die Lebensspanne der Nematoden zeigten. Zwei dieser HPCCC Fraktionen (PS01_04 uns PS01_07) wurden im Laufe dieser Arbeit durch Sephadex-Säulenchromatographie aufgetrennt und zwei daraus gewonnene Isolate mittels 1D- und 2D-NMR-Strukturaufklärung als Pterostilbene (PS-A) und Santal (PS-B) identifiziert. Beide Verbindungen wurden bereits für P. santalinus beschrieben.
Um die Isolierung und Charakterisierung weiterer bioaktiver Inhaltsstoffe zu ermöglichen, wurde im nächsten Schritt eine große Menge der polaren, stark färbenden Pigmente des Rohextraktes PtesanXDM durch Flüssig-Flüssig-Chromatographie mittels eines Scheidetrichters abgetrennt. Die gewonnene, mit Sekundärmetaboliten angereicherte bzw. Pigment-abgereicherte Fraktion (PtesanXDM_DCM), die die Lebensspanne der Würmer verlängerte, wurde phytochemsich untersucht und mittels Puriflash Interchim in die Fraktionen PSD01_01 – PSD01_04 weiter aufgetrennt. Jede Fraktion, die während der phytochemischen Aufarbeitung aus PtesanXDM gewonnen wurde, wurde im C. elegans Lifespan-Assay ausgetestet. Die Fraktion PSD01_01 führte bei einer Konzentration von 10 µg/mL zu einer nicht signifikanten DT50-Verlängerung (= death-time 50%; DT50) von 19.4%; die Fraktion PSD01_02 verringerte interessanterweise bei 25 µg/mL den DT50-Wert signifikant um 31.6%. Bei der niedrigeren Konzentration von 10 µg/mL war dieser lebenszeitverkürzende Effekt aufgehoben. Die Fraktion PSD01_03 stellte die aktivste und komplexeste Fraktion dar und verlängerte - vergleichbar mit der Positivkontrolle Reserpin - die mittlere Überlebensrate der Nematoden um 36.9% (25 µg/mL) und 36.2% (10 µg/mL; jeweils p < 0.05) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Untersuchung der Fraktion PSD01_03 wird Gegenstand weiterer Arbeiten am Department sein. Die mit Pigmenten angereicherte Fraktion PSD01_04 zeigte kaum Auswirkungen auf die Lebensspanne von C. elegans. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden die Fraktionen PSD01_01 und PSD01_02 über eine Kopplung der Puriflash Interchim mit der HPCCC weiter fraktioniert. Die Fraktion PSD01_01 wurde weiter in drei Fraktionen PSD02_01 – PSD02_03 und die Fraktion PSD01_02 in acht Fraktionen PSD03_01 – PSD03_08 aufgetrennt. Alle Unterfraktionen wurden im C. elegans-Lifespan-Assay auf einen möglichen lebensverlängernden Effekt untersucht. PSD02_01 - PSD02_03 konnten den DT50-Wert der Nematoden um 20.9% (p < 0.05), 16.2% (n.s.) bzw. 24.5% (p < 0.01) erhöhen. Zudem führten PSD03_01, PSD03_03 und PSD03_04 signifikant zu einer DT50-Verlängerung von 19.8% (p < 0.05), 31.7% (p < 0.01) bzw. 25.1% (p < 0.01). PSD03_05 zeigte signifikant verkürzende Effekte auf die mittlere Überlebensrate der Nematoden mit einer DT50-Reduktion von 28.2% (p < 0.01).
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die zuvor generierten HPCCC Fraktionen PS01_01 – PS01_13 des Rohextraktes PtesanXDM in unterschiedlichen C. elegans Assays an Wildtyp Würmern (N2), daf-16 loss-of-function (CF1038) und skn-1 loss-of-function (EU1) Würmern untersucht. In einem Lifespan-Assay mit den Wildtyp-Würmern (N2) führten die Fraktionen PS01_01, PS01_05, PS01_08 und PS01_13 zu einer signifikanten DT50-Erhöhung von 25.1% (p < 0.01), 17.6% (p < 0.05), 16.7% (p < 0.05) und 19. 0% (p < 0.05). Im Gegensatz dazu verursachte PS01_04 eine signifikante Abnahme der mittleren Überlebensrate um 33.5% (p < 0.01) im Vergleich zur Vehikelkontrolle. Die lebensverlängernden/verkürzenden Effekte dieser Fraktionen konnten in einem Lifespan-Assay mit den daf-16 Loss-of-Function-Mutanten nicht nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass alle Fraktionen, mit Ausnahme der Fraktion PS01_04, von der Anwesenheit des Transkriptionsfaktors Daf-16 abhängig sind. Des Weiteren wurde ein Juglon-induzierter Stressresistenz-Assay sowohl mit Wildtyp-Würmern als auch mit daf-16 Loss-of-Function-Mutanten durchgeführt. Auch hier zeigte sich, dass die Stressresistenz der Wildtyp-Würmer von der Anwesenheit von daf-16 abhängig ist. Im Gegenzug konnte der Stressresistenz-Assay mit skn-1 loss-of-function Mutanten die lebensverlängernde Wirkung von PtesanXDM bestätigen, was darauf hindeutet, dass die lebensverlängernde Wirkung der Wildtyp-Würmer nicht von der Anwesenheit des Transkriptionsfaktors skn-1 abhängig ist.
Abstract
(Englisch)
Since the beginning of time, understanding the aging process has been a central question in human history. The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been one of the most important model organisms in aging research for decades. This diploma thesis is dedicated to Pterocarpus santalinus L.f., commonly known as red sandalwood. Its methanol-dichloromethane generated heartwood extract showed promising lifespan prolonging effects on the nematodes on the one hand and is still insufficiently phytochemically studied on the other hand. The following work can be thematically divided into two sections: (i) Isolation and Characterization of bioactive constituents from P. santalinus affecting the healthspan of C. elegans and (ii) the phenotypic screening of selected samples affecting the healthspan of C. elegans.
In a previous study, a large-scale extraction of P. santalinus heartwood (PtesanXDM) was performed and 13 fractions (PS01_01 - PS01_13) were subsequently generated by High-Performance Counter-Current Chromatography (HPCCC), which showed significant activity on the nematode lifespan in a C. elegans lifespan assay. Two of these HPCCC fractions, namely PS01_04 and PS01_07 were further separated by sephadex column chromatography (CC) during the course of this work and two isolates were identified as pterostilbene (PS-A) and santal (PS-B) by 1D- and 2D-NMR structural elucidation. Both compounds have previously been described for P. santalinus.
To facilitate the isolation and characterization of additional bioactive constituents, the next step was to separate a large amount of the polar, highly staining pigments of the crude extract PtesanXDM by liquid-liquid chromatography. The obtained fraction PtesanXDM_DCM, enriched with secondary metabolites was able to prolong the lifespan of the worms whereas the pigment-enriched fraction PtesanXDM_MW showed no effects in the C. elegans lifespan assay. PtesanXDM_DCM was further separated into 4 sub-fractions (i.e. PSD01_01 - PSD01_04) via Puriflash Interchim. Each fraction obtained from the phytochemical workup was again tested in the C. elegans lifespan assay. At a concentration of 10 µg/mL, fraction PSD01_01 resulted in a DT50 prolongation (= death-time 50%; DT50) of 19.4% (although not significant); interestingly, at 25 µg/mL, fraction PSD01_02 significantly decreased the DT50 value by 31.6%. At the lower concentration of 10 µg/mL, this life-shortening effect disappeared. Fraction PSD01_03 represented the most active and complex fraction. Similarily than the positive control reserpine, this fraction prolonged the mean survival of nematodes by 36.9% and 36.2% (at 25 and 10 µg/mL, respectively; p < 0.05 in each case) compared to the untreated control. The study of fraction PSD01_03 will be the subject of further work at the Division of Pharmacognosy. The pigment-enriched fraction PSD01_04 showed little effect on C. elegans lifespan.
Within the scope of this diploma thesis, fraction PSD01_01 and PSD01_02 were further fractionated via hyphenation of the Puriflash Interchim with the HPCCC. PSD01_01 was separated into tree sub-fractions (i.e. PSD02_01 - PSD02_03), whereas PSD01_02 into eight sub-fractions (i.e PSD03_01 - PSD03_08). All sub-fractions were assayed for lifespan prolongation in the C. elegans lifespan assay. PSD02_01 - PSD02_03 were able to increase the DT50 value of nematodes by 20.9% (p < 0.05), 16.2% (n.s.) and 24.5% (p < 0.01), respectively. Further, PSD03_01, PSD03_03 and PSD03_04 significantly resulted in DT50 prolongation of 19.8% (p < 0.05), 31.7% (p < 0.01) and 25.1% (p < 0.01), respectively. On the contrary, PSD03_05 showed detrimental effects on the mean survival rate of nematodes with a DT50 reduction of 28.2% (p < 0.01).
In the second part of the present thesis, previously generated HPCCC fractions of the crude extract PtesanXDM, namely PS01_01 - PS01_13, were examined in different
C. elegans assays on wild-type worms (N2), daf-16 loss-of-function (CF1038) and skn-1 loss-of-function (EU1) mutants. In a lifespan assay with the wild-type worms (N2), fractions PS01_01, PS01_05, PS01_08 and PS01_13 resulted in a significant DT50 increase of 25.1% (p < 0.01), 17.6% (p < 0.05), 16.7% (p < 0.05) and 19.0%
(p < 0.05), respectively. On the contrary, PS01_04, caused a significant decrease of the mean survival rate by 33.5% (p < 0.01) when compared to the vehicle control. The lifespan-prolonging/shortening effect of these fractions could not be detected in a lifespan assay using the daf-16 loss-of-function mutants, suggesting that all fractions, with the exception of fraction PS01_04, are dependent on the presence of the transcription factor daf-16. Further, a juglone-induced stress resistance assay was performed with both, wild-type worms and daf-16 loss-of-function mutants. Again, it was shown that the stress resistance of wild-type worms is dependent on the presence of daf-16. In turn, the stress resistance assay with skn-1 loss-of-function mutants could confirm the lifespan prolonging effect by PtesanXDM, suggesting that the lifespan prolonging effect of the wild-type worms is not dependent on skn-1.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Pterocarpus santalinus Caenorhabditis elegans
Schlagwörter
(Deutsch)
Pterocarpus santalinus Caenorhabditis elegans
Autor*innen
Karina Ptak
Haupttitel (Englisch)
Isolation and characterization of bioactive constituents from Pterocarpus santalinus affecting the healthspan of Caenorhabditis elegans
Paralleltitel (Deutsch)
Isolierung und Charakterisierung bioaktiver Inhaltsstoffe von Pterocarpus santalinus welche die Gesundheitsspanne von Caenorhabditis elegans beeinflussen
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
72 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Judith M. Rollinger
AC Nummer
AC16315078
Utheses ID
60412
Studienkennzahl
UA | 449 | | |