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Selection of aptamer candidates against rhinovirus
a comparison of conventional with HT-SELEX
Nadine Löffler
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Heinrich Kowalski
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-11251.72980.743921-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Aptamere stellen eine günstige Alternative zu klassischen Antikörpern, mit ähnlichen Bindungsaffinitäten, dar und wurden als solche vielfach zum Nachweis von Viren, sowie deren Inhibierung verwendet. Ziel dieser Arbeit war es, spezifische DNA Aptamere gegen das native Rhinovirus A2, sowie dessen A und B Partikel mittels „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment“ (SELEX) zu generieren. Zuerst wurden Aptamer Kandidaten mittels einer konventionellen Filter-basierten SELEX gegen das native RV-A2 selektiert. Nach Vektorklonierung und Sanger-Sequenzierung wurden identifizierte Kandidaten mit einem „Aptamer Gel Partitioning Assay“ und einem „Fluoreszenz-ALISA“ auf ihre Bindungsaffinität getestet. Obwohl keine der getesteten Aptamere eine spezifische Bindung aufwies, konnte dabei der „Fluoreszenz-ALISA“ als geeignete Methode zur Testung der Bindungsaffinität etabliert werden. Die Arbeit wurde um fünf weitere „High-Troughput“ Selektionsversuche erweitert, in denen der Selektionsfortschritt mittels „Next Generation Sequencing (NGS)“ ermittelt wurde. Dabei wurde die Filter-basierte SELEX um zwei verschiedenen Faltungsprotokolle der DNA-Sequenzen erweitert. Zusätzlich wurde mit einer „Bead“-basierten Methode gegen das native RV-A2 und die viralen A und B Partikel selektiert. NGS Analyse zeigte, dass die Diversität der Sequenzen und die Zahl an nicht-angereicherten Sequenzen (Kopie Zahl = 1) bis zur zwölften und letzten Selektionsrunde hoch blieb. Potenzielle RV-A2 Aptamere konnten durch ihre frühe und teils wellenhafte Anreicherung während der SELEX identifiziert werden. Zum ersten Mal konnte durch HT-SELEX eine Sequenzanreicherung abhängig von dem Faltungsprotokoll, einem schnellen Abkühlen der Sequenzen auf 4 °C und einem langsamen Falten bei 25 °C, demonstriert werden.
Abstract
(Englisch)
Aptames are a powerful tool to both detect and inhibit viral infection. They present a cost effective and viable alternative to classical antibodies and have been generated against viral targets with binding affinities similar to those of antibodies. This study aimed to select DNA aptamers against Rhinovirus A2 (RV-A2) native and subviral particles by Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX). Initally, a conventional SELEX was used to isolate aptamer candidates against native RV A2, with ultrafiltration serving for library partitioning. Target affinity of DNA sequences identified by subcloning and Sanger sequencing could not be shown with an aptamer gel partitioning assay or in a fluorescent-ALISA. Though the latter could be estabilished as a quick and robust technique of testing RV targeting aptamers retrieved in future efforts. In order to increase the chances for identification of RV-specific aptamers, a high-throughput (HT) SELEX was implemented, where the selection progress was monitored with Next Generation Sequencing (NGS). Apart from the native RV-A2 particle, aptamers were also selected against the subviral A and B particles. In addition, two protocols for refolding of the random DNA library and two distinct partitioning techniques (ultrafiltration and magnetic beads) were compared. A great heterogeneity of the sequence pool was found throuhout the selection process. Some aptamers appeared in a wave-like pattern in filter-based selection. Early enriched sequences might constitute possible RV-A2 binding candidates. The non-equivalency of the two library refolding protocolls, snap-cooling and slow refolding, was indicated for the first time in HT-SELEX.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
rhinovirus SELEX HT-SELEX aptamers
Schlagwörter
(Deutsch)
Rhinovirus SELEX HT-SELEX Aptamere
Autor*innen
Nadine Löffler
Haupttitel (Englisch)
Selection of aptamer candidates against rhinovirus
Hauptuntertitel (Englisch)
a comparison of conventional with HT-SELEX
Paralleltitel (Deutsch)
Selektion von Aptamer Kandidaten gegen Rhinoviren
Paralleluntertitel (Deutsch)
ein Vergleich zwischen konventioneller und HT-SELEX
Publikationsjahr
2021
Umfangsangabe
117 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Heinrich Kowalski
Klassifikationen
42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.32 Virologie
AC Nummer
AC16504469
Utheses ID
61097
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1