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Ultrastructural and proteomic alterations induced by hypoxic and shear stress in human ovarian cancer cells

Michelle Kriz

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Biologische Chemie

Betreuer*in

Christopher Gerner

Mitbetreuer*in

Giorgia Del Favero

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DOI

10.25365/thesis.70808

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-11261.47485.682526-1

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Eierstockkrebs gehört zu den tödlichsten malignen Erkrankungen bei Frauen, mit einem allgemein ungünstigen Krankheitsverlauf, aufgrund der üblicherweise späten Diagnose. Spät diagnostizierter Eierstockkrebs bedeutet in der Regel auch ein fortgeschrittenes Stadium und hat meist bereits Metastasen gebildet. Die herkömmliche Behandlung für progressiven Eierstockkrebs umfasst einen chirurgischen Eingriff und eine platinhaltige Chemotherapie, wobei der Großteil der Patientinnen einen Rezidiv erleidet und ein wiederkehrender Eierstockkrebs aufgrund einer entwickelten Chemoresistenz nicht mehr heilbar ist. Für die Entwicklung dieser Chemoresistenz bei Eierstockkrebs gelten zwei Faktoren als besonders entscheidend, nämlich Hypoxie und fluide Scherbelastung. Hypoxie reguliert viele Signalwege und somit auch das Krebswachstum, und beeinflusst posttranslationale Modifikationen verschiedener Proteine. Scherbeanspruchung beeinflusst die Morphologie, die Expression von Biomarkern und die Aggressivität von Tumorzellen, und bietet so eine ideale Mikroumgebung für Tumore. Sowohl Hypoxie wie auch fluide Scherbelastung wird eine Auswirkung auf die mitochondriale Morphologie und die Proteinzusammensetzung der elektronentransportkette zugesprochen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei menschliche Eierstockkrebs-Zelllinien (SKOV-3 und OVCAR-3) dem Sauerstoffgehalt (Hypoxie) oder der biophysikalischen Stimulierung (Scherbeanspruchung) des Milieus eines Eierstockkrebses ausgesetzt, um die tatsächliche Umgebung, wie sie in vivo ist akkurater zu imitieren. Die Zellen wurden vor und nach den jeweiligen Behandlungen mikroskopisch überprüft und abgebildet, um anschließend die morphologischen Veränderungen in Hinblick auf Fläche, Umfang Haupt- und Nebenachsen, Zirkularität und Rundheit der Zellen zu evaluieren. Des Weiteren wurden proteomische Veränderungen mittels Massenspektrometrie (Zellaufschluss, proteolytische Spaltung und LC-MS/MS) bestimmt, und schließlich wurden regulierte Proteine und folglich die betroffenen Signalwege durch bioinformatische Auswertung ermittelt. Je nach Art der Proteom-Analyse (ungezielte Proteom-Analyse oder Phospho-Proteom-Analyse) wurden die Zellen für 24 Stunden (Langzeit) beziehungsweise für 3 Stunden (Kurzzeit) den beiden Bedingungen ausgesetzt. Es konnten für beide Zelllinien unter jeder Versuchsbedingung nach 24-stündiger Behandlung sowohl morphologische als auch proteomische Veränderungen ermittelt werden, mit Proteinidentifikationen, die mit denen in der Literatur beschriebenen übereinstimmen und darüber hinausgehen. Ausgehend von den 3-stündigen Inkubationen konnten die verschiedenen Behandlungsgruppen (hypoxisch, scherbeansprucht, und normoxische statische Kontrolle) mittels PCA nur vage voneinander getrennt werden, und in den grundlegenden proteomischen Profilen beider Zelllinien konnten fast keine regulierten Proteine identifiziert werden. Eine ausführliche molekulare Interpretation und Diskussion der Proteomik Daten würde den Rahmen dieser Masterarbeit überschreiten, da das Ziel die Erstellung eines geeigneten Experimentaufbaus und erste Erkenntnisse über die Auswirkungen von künstlicher Hypoxie und fluider Scherbelastung auf Ovarialkarzinom-Zelllinien mit den jeweiligen Methoden war. Zusammenfassend konnten wir für beide Zelllinien nach beiden Behandlungen im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollzellen signifikante morphologische und proteomische (ungezielte sowie Phospho) Veränderungen feststellen. Dies deutet darauf hin, dass die eingesetzten Methoden zur Nachahmung der Mikroumgebung eines Eierstockkrebses geeignet sind.

Abstract

(Englisch)

Ovarian cancer is one of the most lethal malignancies among women. It is a disease with a generally unfavorable outcome due to late diagnosis, and late stage ovarian cancer has typically already started to metastasize. For advanced stage ovarian cancer, the usual care is surgery and platinum-based chemotherapy, whereby most patients experience a relapse of cancer, and a recurring ovarian cancer is not curable, which can be attributed to a developed chemoresistance. Based on current knowledge, two well-known factors contribute significantly to the development of chemoresistance in ovarian cancer, namely hypoxia and shear stress. Hypoxia regulates many signaling pathways and thus cancer growth and influences post-translational modifications of various proteins. Shear Stress impacts morphology, expression of biomarkers, and aggressiveness of tumor cells, providing an ideal tumor microenvironment. Both hypoxia and shear stress are though to affect mitochondrial morphology and protein composition of the electron transport chain Within this thesis, two human ovarian cancer cell lines (SKOV-3 and OVCAR-3) were subjected to the oxygen level (hypoxia) or the biophysical stimulation (shear stress) of an ovarian cancer environment to mimic the in vivo situation more accurately. Cells were microscopically monitored and imaged prior and after the respective treatments, to subsequently evaluate the morphological alterations with respect to area, perimeter, major and minor axes, circularity, and roundness of the cells. Furthermore, proteomic alterations were determined using mass spectrometric analysis (cell lysis, proteolytic digestion, and LC-MS/MS), and finally, regulated proteins and thus the affected signaling pathways were identified by bioinformatic analysis. Depending on the proteomic analysis (untargeted proteomic or phosphoproteome analysis), cells were treated for 24 h (long-term) or 3 h (short-term), respectively. For both cell lines, morphological as well as proteomic alterations could be determined after 24 h treatment in the respective experimental condition, with identified proteins consistent with and exceeding those reported in literature. Based on the 3 h incubations, the different treatment groups (hypoxic, shear stress, and normoxic static control) could only be vaguely separated from each other via PCA, and almost no regulated proteins could be identified in the basic proteomic profiles of both cell lines. An exhaustive molecular interpretation and discussion of the proteomics data is beyond the scope of this master’s thesis, as the aim was to create a suitable experimental design and to gain first insights into the impacts of artificial hypoxia and fluid shear stress using the respective methods on ovarian cancer cell lines. In conclusion, we identified significant morphological and proteomic (untargeted as well as phospho-proteomic) alterations for both cells lines after both treatments compared to the control cells, suggesting the methods are suitable for mimicking the ovarian cancer microenvironment more adequately.

Autor*innen

Michelle Kriz

Haupttitel (Englisch)

Ultrastructural and proteomic alterations induced by hypoxic and shear stress in human ovarian cancer cells

Paralleltitel (Deutsch)

Ultrastrukturelle und proteomische Veränderungen, die durch Hypoxie und Scherstress in menschlichen Eierstockkrebszellen hervorgerufen werden

Publikationsjahr

2021

Umfangsangabe

VIII, 41, xi Seiten : Illustrationen

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christopher Gerner

Klassifikationen

35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines ,

35 Chemie > 35.26 Massenspektrometrie ,

35 Chemie > 35.39 Analytische Chemie: Sonstiges ,

35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,

35 Chemie > 35.76 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße ,

35 Chemie > 35.79 Biochemie: Sonstiges ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC16512184

Utheses ID

61215

Studienkennzahl

UA | 066 | 863 | |

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