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The role of MAP1B and NO in axon guidance

Ewa Krupa

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Friedrich Propst

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29467.39659.349760-4

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Mikrotubuli assoziiertes Protein 1B (MAP1B) ist während der Embryonalphase am stärksten exprimiert und wird nach der Geburt hinunterreguliert. Es wird als Polyprotein synthetisiert, welches anschließend in eine schwere Kette (HC) und eine leichte Kette (LC) gespalten wird. Aufgrund der Fähigkeit von MAP1B sowohl Aktin als auch Mikrotubuli zu binden, wird es als Quervernetzer der beiden Zytoskelettbestandteile angesehen. MAP1B-/- Mäusen fehlt das Corpus Callosum, ein ausgesprochen wichtiger Nerventrakt, der die zwei Gehirnhälften verbindet. Daher kommt die Vermutung, dass MAP1B essentiell für die korrekte Führung der Nerven während der Entwicklung ist. Außerdem kommt es in MAP1B-/- Mäusen zu einem verringerten Axondurchmesser, einer dünneren Myelinschicht und einer Reduktion der Nervenleitgeschwindigkeit (Meixner et al., 2000). Stickoxid (NO) ist ein Signalmolekül welches von Stickoxidsynthasen (NOS) synthetisiert wird. Es spielt eine Rolle als Neurotransmitter und Neuromodulator. In geringen Konzentrationen unterstützt NO physiologische Prozesse, doch sobald die Konzentration zu stark ansteigt, kann es toxisch auf Nervenzellen wirken. Es wurde herausgefunden, dass NO wichtig für die Entwicklung des visuellen Systems in Hühnern (Wu et al., 2004) ist und, dass es zu Retraktion von kultivierten embryonalen Hühner DRG Neuronen führt (He et al., 2002). NO-induzierte Axonretraktion findet in MAP1B-/- DRG Neuronen nicht statt da dafür die S-Nitrosylierung der leichten Kette von MAP1B am cys2457 nötig ist (Stroissnigg et al., 2007). Im ersten Teil meiner Dissertation untersuchte ich die mögliche Mitwirkung von NO in zwei physiologischen Axonretraktionsparadigmen: die repulsive Axonführung durch Lysophosphat-Säure (LPA) und die Inhibierung der Axonregeneration durch Myelin und Chondroitin Sulfat Proteoglykane (CSPG). Ich stellte fest, dass LPA-induzierte Axonretraktion nicht von nNOS abhängig ist, aber sehr wohl MAP1B, Rho-assoziierte Kinase (ROCK) und Myosin benötigt. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit vorherigen Studien. Ich analysierte auch ob NO und MAP1B an der Inhibierung des axonalen Wachstums durch Myelin und CSPGs beteiligt sind. Doch die Inhibierung von NO-Synthasen und nNOS im Speziellen konnte das Wachstum der Axone unter diesen Umständen nicht positiv beeinflussen. Das war sowohl in Wildtyp als auch in MAP1B-/- DRG Neuronen der Fall. Im zweiten Teil meiner Dissertation wollte ich Näheres über den grundlegenden Mechanismus herausfinden der hinter der NO-induzierten Axonretraktion steht. Um die NO-Konzentration in Neuronen zu erhöhen, verwendete ich Calcimycin welches die Kalziumkonzentration in der Zelle erhöht, was unter anderem zur Aktivierung von nNOS führt. Ich fand heraus, dass CaMKII, Calcineurin, Calpain und Protein Kinase C (PKC) nicht für Calcimycin-induzierte Axonretraktion benötigt werden, doch die Involvierung von nNOS konnte ich bestätigen. Weiters entdeckte ich, dass ROCK Aktivität und Myosin essentiell für die NO-induzierte Axonretraktion sind, da deren Inhibierung sowohl Calcimycin- als auch NO-Donor-induzierte Retraktion in DRG Neuronen und N2a Zellen verhindert. Außerdem wurde die Monophosphorylierung der regulierenden leichten Kette von Myosin (MRLC) durch den Einfluß von NO erhöht, was darauf hindeutet, dass NO die Aktivität von Myosin ankurbelt. Die Stimulierung von cAMP konnte teilweise die NO-induzierte Axonretraktion verhindern. Ich konnte zeigen, dass NO-, Calcimycin- und LPA-induzierte Axonretraktion nicht durch Mikrotubulidepolymerisation zustande kommt. Stabilisierung von Mikrotubuli durch Taxol führt zu Axonretraktion. Diese zeigt dieselben Kennzeichen wie sie auch bei einer Retraktion durch einen NO-Donor, Calcimycin oder LPA zu sehen sind. Was hier allerdings nicht involviert war, ist die Aktin-Myosin-Kontraktion. Die Bindung von MAP1B an Mikrotubuli wird durch die Behandlung mit einem NO-Donor oder LPA in nicht-neuronalen PtK2 Zellen verstärkt. Die Dynamik der Mikrotubuli-Plusenden wurde mit Hilfe einer in vivo Markierung mit GFP-markiertem end binding Protein (EB1-GFP) analysiert. In MAP1B-/- DRG Neuronen ist die Geschwindigkeit der Kometen höher, die Distanz welche sie zurücklegen größer, die Lebensdauer länger und deren Anzahl höher. Alle Parameter wurden in Bezug auf die Axonlänge und pro Wachstumskegelfläche gemessen. Daraus schliesse ich, dass in Wildtyp DRG Neuronen MAP1B stabilisierend und schützend auf die Mikrotubuli wirkt. In MAP1B-/- Neuronen haben Mikrotubuliteilende Proteine leichteren Zugang zu denselben und schneiden diese in kleine dynamischere Teile, was wiederum zu vermehrter Axonverzweigung führt. LPA-Behandlung verringerte die Geschwindigkeit der Kometen, deren Lebensdauer und deren Anzahl in Wildtyp DRG Neuronen. In Anbetracht all dieser Ergebnisse kann man zu dem Schluss kommen, dass LPA und NO die Konformation von MAP1B ändern und somit seine Mikrotubulibindungskapazität erhöhen. Dadurch werden Mikrotubuli zu stark stabilisiert und das führt zur Axonretraktion. Im dritten Teil der Dissertation studierte ich die Rolle von MAP1B in Laminin/Integrin Signaltransduktionswegen. Ich beobachtete eine unterschiedliche Morphologie der DRG Neuronen wenn sie auf Laminin oder Poly-L-Lysin kultiviert wurden. Die Inhibierung der Cdk5 durch Roscovitin induzierte Axonretraktion in Wildtyp DRG Neuronen. MAP1B-/- Neuronen reagierten anders auf diese Behandlung. Retraktion durch Cdk5-Inhibierung benötigt ROCK und Myosin und konnte nur bei Neuronen gesehen werden, die auf Laminin gewachsen waren. Inhibierung von GSK3β konnte teilweise die Axonretraktion durch Roscovitin verhindern, doch nNOS-Inhibierung hatte keinen Einfluss darauf. Außerdem verstärkte Roscovitin die Bindung von MAP1B an Mikrotubuli in PtK2 Zellen was an die Eigenschaften von LPA- und NO-induzierter Axonretraktion erinnert. Somit scheint es als würden Laminin/Integrin Signaltransduktionswege sowohl beim Axonwachstum als auch bei der Axonretraktion eine Rolle spielen.

Abstract

(Englisch)

Microtubule associated protein 1B (MAP1B) is expressed at the highest level during early stages of embryogenesis and is downregulated after birth. It is synthesized as polyprotein that is cleaved into heavy chain (HC) and light chain (LC1). Due to microtubule and actin binding properties MAP1B is proposed to be a crosslinker between cytoskeletal components. MAP1B-/- mice are characterized by the lack of corpus callosum, a prominent axon tract connecting the two cerebral hemispheres, suggesting a role of MAP1B in axon guidance. In addition, in the peripheral nervous system reduced diameters of axons, decreased thickness of the myelin sheaths and reduction in conduction velocity were observed (Meixner et al., 2000). Nitric oxide (NO) is a messenger molecule, synthesized by nitric oxide synthases (NOSs), which plays a role as neurotransmitter and neuromodulator. At low concentrations NO contributes to physiological processes, whereas at high concentration NO was found to be toxic for cells of the nervous system. NO was found to play an important role in retinotectal pruning during development of chick visual system (Wu et al., 2004) and to induce axon retraction in cultured embryonic chicken DRG neurons (He et al., 2002). Axon retraction induced by NO was impaired in MAP1B-/- DRG neurons and was shown to involve S-nitrosylation of LC1 on cys2457 as a critical step (Stroissnigg et al., 2007). In the first part of my thesis I examined the potential involvement of NO in two physiological axon retraction paradigms, repulsive axon guidance by lysophosphatidic acid (LPA) and myelin and Chondroitin Sulfate Proteoglycane (CSPG) inhibition of axon regeneration. I found that LPA-induced axon retraction does not require activation of nNOS, but it involves MAP1B, the Rho-associated kinase (ROCK) and myosin, consistent with previous studies. I also analyzed whether NO and MAP1B are implicated in inhibition of axon growth triggered by myelin and by CSPGs, but inhibition of nNOS and NOSs in general did not overcome inhibitory properties of neither CSPGs or myelin. Growth of both wild-type and MAP1B-/- DRG neurons was affected by myelin and CSPGs. In the second part of my thesis I investigated the mechanism underlying NO-induced axon retraction. To increase NO levels, neurons were treated with calcimycin, which enhances Ca2+ levels resulting in activation of nNOS. An increase of Ca2+ can activate potentially also Ca2+ effectors other than nNOS. I found that CaMKII, calcineurin, calpain and protein kinase C (PKC) are not involved in calcimycin-induced axon retraction of DRG neurons, whereas I confirmed involvement of nNOS. Further, I showed that ROCK activity and myosin are essential for NO-induced axon retraction, since inhibition of either ROCK or myosin prevented both calcimycin- and NO donor-induced retraction of neurites in mouse DRG neurons and in neuroblastoma N2a cells. In addition, in N2a cells monophosphorylation of the myosin regulatory light chain (MRLC) upon treatment with NO donor was enhanced, suggesting that NO can increase myosin activity. Stimulation of cAMP partially abolished NO-induced axon retraction. I also showed that NO-, calcimycin- and LPA-induced retractions of axons are not due to depolymerization of microtubules. I found that stabilization of microtubules by taxol leads to axon retraction with hallmarks similar to retraction observed upon treatment with an NO donor, calcimycin or LPA, but it does not involve acto-myosin contractility. Moreover, NO donor and LPA treatment increased binding of MAP1B with microtubules in non-neuronal PtK2 cells. Analysis of the dynamics of microtubule plus ends by in vivo labelling with GFP-tagged end-binding protein 1 (EB1-GFP), revealed that in MAP1B-/- DRG neurons the velocity, the distance, the time of EB1-GFP comet life and the number of comets per axon length and per growth cone area were enhanced when compared to wild-type DRG neurons. I propose that in wild-type DRG neurons MAP1B binds to microtubules stabilizing and protecting them from severing proteins. In MAP1B-/- neurons lack of MAP1B results in enhanced accessibility of microtubules for severing proteins that cut long microtubules into short dynamic ones, leading to excessive axon branching. Finally, treatment with LPA reduced the velocity, the time of EB1-GFP comet life and the number of comets per axon length in axons of wild-type DRG neurons. Taken together, these results I suggest that LPA and NO induce conformational changes in MAP1B increasing its microtubule binding activity. In the effect microtubules are overstabilized by MAP1B leading to axon retraction. In the third part of my thesis, I examined involvement of MAP1B in laminin/integrin signaling. I found that the different morphology of wild-type versus MAP1B-/- DRG neurons can be observed when neurons are cultured on laminin, but not on poly-L-lysine only. Inhibition of cdk5 with roscovitine induced axon retraction in wild-type DRG neurons. In MAP1B-/- DRG neurons the response to roscovitine was altered. Retraction induced by inhibition of cdk5 involved ROCK and myosin, and was observed only when neurons were grown on laminin. Inhibition of GSK3β partially prevented axon retraction induced by roscovitine, whereas inhibition of nNOS had no influence. In addition, roscovitine increased microtubule binding of MAP1B in PtK2 cells, suggesting a similar mechanism as in case of LPA- and NO-induced axon retraction. Thus, laminin/integrin signalling seems to play role both in promotion of axon growth and axon retraction.

Autor*innen

Ewa Krupa

Haupttitel (Englisch)

The role of MAP1B and NO in axon guidance

Paralleltitel (Deutsch)

Die Funktion von MAP1B und NO in der Führung von Axonen

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

232 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Johannes Nimpf ,

Frank Bradke

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC07452272

Utheses ID

6128

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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Schlagwörter