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Optimization of the lentivirus production for the efficient transduction of primary murine macrophages

Katrin Anna Christina Spiesberger

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Thomas Decker

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DOI

10.25365/thesis.6811

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29927.78481.746461-6

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Lentiviren können im Gegensatz zu allen anderen Retroviren ihre virale DNS unabhängig vom Zellteilungsstadium der Wirtszelle in das Wirtsgenom integrieren. Dadurch können sie mitotisch inaktive Zellen transduzieren. In dieser Arbeit haben wir getestet, ob das “ViraPower™ T-REx™ Lentiviral Expression System” (Invitrogen) geeignet ist primäre Makrophagen effizient zu transduzieren. Dieses System besteht aus einem Expressionsvektor, der das zu transferierende Gen enthält, und einem Verpackungssystem aus drei Plasmiden, das für die Vektorpartikelproduktion benötigt wird. Um die Transduktionseffizienz bewerten zu können, verwendeten wir das grün fluoreszierende Protein (GFP) als Reportergen. Die Virusproduktion und die Bestimmung der viralen Titer durch Selektion Antibiotika-resistenter Zellklone wurden entsprechend dem Originalprotokoll durchgeführt. Aufgrund zu niedrigen, so erhaltenen Titerwerten wurde kein ausreichendes Verhältnis von infektiösen Viruspartikeln zu Zellen erreicht, welches zu einer erfolgreichen Transduktion der Zellen geführt hätte. In der Folge versuchten wir durch Modifikationen des Originalprotokolls die viralen Titer zu erhöhen. Diese umfassten Virusproduktion unter der Verwendung eines 2-Plasmid-Verpackungssystems, Virusproduktion im größeren Maßstab durch die Erhöhung der Anzahl der Virus produzierenden Zellen und Konzentration der viralen Überstände durch Ultrazentrifugation. All diese Ansätze führten zu einem deutlichen Titeranstieg, sodass wir in primären Zellen eine mittlere bis starke GFP Expression nachweisen konnten. Zusätzlich zur konventionellen Titration wurde die Aktivität der viralen reversen Transkriptase (RT) durch eine „product-enhanced reverse transcriptase“ (PERT) Analyse bestimmt. Die gemessenen RT Aktivitäten stimmten mit den Transduktionsergebnissen der primären Zellen überein und wir konnten zeigen, dass die PERT Analyse eine verlässliche Methode ist um die Transduktionskapazität von lentiviralen Überständen einzuschätzen.

Abstract

(Englisch)

In contrast to other retroviruses, lentiviruses do not require mitosis for viral DNA integration into a host genome and thus are able to transduce non-dividing cells. In this study we evaluated the ViraPower™ T-REx™ Lentiviral Expression System (Invitrogen) in terms of efficient transduction of differentiated primary cells. This system consists of a transfer expression vector containing the gene of interest, and a three plasmid packaging system required for vector particle production. To assess the transduction efficiency of viral preparations, the green fluorescent protein (GFP) was used as a reporter gene. Virus production and titer determination by selection of antibiotic-resistant cell clones was performed as recommended, but the achieved multiplicity of infection was too low for the successful transduction of primary cells. Subsequently, we applied modifications to the original protocol in order to increase viral titers. This included the use of a two plasmid packaging system, the scale-up of virus production by the increase of the total amount of transfected cells and the concentration of viral supernatants by ultracentrifugation. All approaches resulted in a clear improvement of the titer. Consequently, the transduction of primary macrophages yielded a moderate to strong expression of GFP. In addition to the conventional titration, the reverse transcriptase activities of viral supernatants were determined by a product-enhanced reverse transcriptase (PERT) assay analysis. The measured activity values were in accordance with the transduction results of the primary cells and we could show, that the PERT assay is a reliable method to predict the transduction capacity of lentiviral supernatants.

Autor*innen

Katrin Anna Christina Spiesberger

Haupttitel (Englisch)

Optimization of the lentivirus production for the efficient transduction of primary murine macrophages

Paralleltitel (Deutsch)

Optimierung der Lentivirus Produktion für die effiziente Transduktion primärer muriner Makrophagen

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

65 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Thomas Decker

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC08166567

Utheses ID

6148

Studienkennzahl

UA | 441 | | |

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Schlagwörter