Detailansicht
Semisynthesis of a lipidated bank vole prion protein
Alexander Buchner
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Biologische Chemie
Betreuer*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
DOI
10.25365/thesis.71135
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-12858.15805.137436-5
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Ziel dieser Arbeit war es ein semisynthetisches, modifiziertes Rötelmaus Prion Protein herzustellen. Es ist bekannt, dass das zelluläre Prion Protein in vivo mit einem Glykosylphosphatidylinositol-Anker (GPI-Anker) verbunden und dadurch in der zellulären Membran verankert ist. Dies erschwert eine direkte Aufreinigung von homogenen Prion-Proteinen, welche eine posttranslationale Modifikation (PTM) wie den GPI-Anker aufweisen. Es wäre jedoch notwendig solch homogene, modifizierte Prion Proteine einfach und vor allem in ausreichenden Mengen produzieren zu können, um im Forschungsbereich der Prion-Erkrankungen voranzuschreiten. Diesbezüglich wurde nach Wegen gesucht, um diese herausfordernde Aufgabe leichter zu bewältigen. Mittlerweile gibt es verschiedene Möglichkeiten Prion Proteine mit PTMs herzustellen. Eine Methode ist die sogenannte „Semisynthese von Proteinen“. Diese beruht auf der Strategie, zwei Polypeptidfragmente des Proteins separat herzustellen und diese sowohl chemoselektiv als auch regioselektiv miteinander zu verbinden. Ein Teil ist das rekombinant exprimierte Protein und der andere ein chemisch-synthetisiertes Peptid. Die Methode der Semisynthese wird zum Beispiel häufig im Bereich des „Protein-Engineering“ eingesetzt, um nicht-kodierte Aminosäuren in Proteine einzubauen. Die ersten Schritte dieser Masterarbeit beinhalteten die rekombinante Expression des vollständigen Rötelmaus Prion Proteins (Aminosäuren 23-231) in E. coli. Das Rötelmaus Prion Protein wurde über präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) aufgereinigt. Ein peptidisches GPI-Anker Mimetikum wurde über die Methode der Festphasenpeptidsynthese hergestellt. Im Zuge der Ligation der beiden Peptidsegmente, genannt „Expressed Protein Ligation“, wurde das GPI-Anker-Mimetikum mit dem vollständigen Rötelmaus Prion Protein verknüpft. Das aufgereinigte Ligationsprodukt wurde im letzten Schritt gefaltet, um die biologische Funktionsfähigkeit für weitere Experimente zu gewährleisten. Die Faltung wurde durch eine Messung mit einem zirkularen Dichroismus (CD) Spektrometer nachgewiesen. Unter der Anwendung dieser Methode, konnte man schon erfolgreich semisynthetische humane und murine Prion Proteine herstellen. Diese modifizierten humanen Prion Proteine werden für in vitro Experimente zur Untersuchung der Entstehung von Prion-Krankheiten, wie z.B.: die Creuzfeldt-Jakob-Krankheit im Menschen, verwendet. Das im Zuge dieser Masterarbeit hergestellte Rötelmaus Prion Protein kann von einem Partner, welchem die Rötelmaus als Modell Organismus zur Verfügung steht, für in vivo Experimente genützt werden, um die Entstehung von Prion Krankheiten genauer untersuchen zu können. Die Kombination aus der Möglichkeit Rötelmaus Prion Proteine einfacher herzustellen und die Verfügbarkeit von Modellorganismen bietet eine Grundlage für die Untersuchung von Prion Krankheiten. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse können eventuell einen Aufschluss über Prion Erkrankungen im Allgemeinen geben.
Abstract
(Englisch)
In this work a semisynthetic modified bank vole prion protein was produced. It is known that the cellular prion protein (PrPC) is linked to the glycosylphosphatidylinositol-anchor (GPI-anchor) in vivo and therefore the prion protein is connected to the cellular membrane. It is difficult to purify homogenous cellular prion proteins, which include posttranslational modifications (PTM), such as the GPI-anchor, in sufficient amounts. However, robust access to homogenously modified prion proteins is required to advance research in the area of prion diseases. Therefore, new ways to overcome the challenging task to produce modified prion proteins were explored. One of these methods is called “semisynthesis of proteins”. In this approach a recombinantly expressed protein and a chemically synthesized peptide are chemoselectively and regioselectively joined together. For example, this method is commonly used in the field of protein engineering to incorporate non-coded amino acids into proteins. The first steps of this master thesis included the recombinant expression of full-length bank vole prion protein (amino acids 23-231) in E. coli. The full-length construct was purified using a preparative high performance liquid chromatography (HPLC) system. In a second step, a GPI-anchor mimicking peptide was chemically synthesized via solid phase peptide synthesis (SPPS). Once the purification was done, the two segments were joined together via a reaction called “Expressed Protein Ligation (EPL)”. Semisynthetic bank vole prion protein was then purified and folded to obtain the correct tertiary structure. Correct folding of the lipidated bank vole prion protein (bvPrP) was proven by performing circular dichroism (CD) measurements. Human (hPrP) and murine prion protein was previously produced by semisynthesis and subsequent usage in in vitro experiments has led to a better insight in the emergence of prion diseases, such as the Creuzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans. The bank vole prion protein that was obtained in this work will be further used to perform in vivo experiments in the bank vole model organism by collaborators in the US. Due to the sequence similarities of the bvPrP with the hPrP the expected results can also provide insights on prion diseases in general.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Semisynthese von Proteinen Rötelmaus Prion Protein Expressed Protein Ligation Posttranslationale Modifikation Lipidierung Festphasenpeptidsynthese GPI-Anker Rekombinante Expression
Schlagwörter
(Englisch)
protein semisynthesis bank vole prion protein Expressed Protein Ligation posttranslational modification lipidation Solid Phase Peptide Synthesis GPI-anchor recombinant expression
Autor*innen
Alexander Buchner
Haupttitel (Englisch)
Semisynthesis of a lipidated bank vole prion protein
Paralleltitel (Deutsch)
Semisynthese eines lipidierten Rötelmaus Prion Protein
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
ix, 92 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
AC Nummer
AC16538569
Utheses ID
62152
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |