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Activation of secondary metabolites biosynthetic gene clusters from Streptomyces strains isolated in the Ethiopian desert for discovery of new biologically active compounds

Michael Maier

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Sergey Zotchev

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DOI

10.25365/thesis.70407

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-26130.32511.750191-8

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Gesundheitsbehörden weltweit warnen vor der steigenden Gefahr von Antibiotika Resistenzen, was letztlich dazu führen könnte, dass antibiotische Arzneistoffe ihre Wirksamkeit verlieren. Im wesentlichen wurde beobachtet, dass alle Antibiotika die heute klinisch eingesetzt werden, von dieser Entwicklung betroffen sind und daher die Notwendigkeit besteht neue Antibiotika zu erforschen und zu entwickeln um so eine Gesundheitskrise abzuwenden. Die Erfahrungen, die über ein Jahrhundert Arzneimittel Entwicklung gesammelt wurden, zeigen, dass Naturstoffe, insbesondere jene, die aus Bakterien und Pilzen isoliert werden konnten, einen vielversprechenden Ausgangspunkt für die Entdeckung und Entwicklung antibiotischer Arzneistoffe darstellen. Actinobacteria, insbesondere Streptomyces spp., haben in der Vergangenheit bewiesen, dass sie in der Lage sind eine große Anzahl an antibiotischen Substanzen zu produzieren. Moderne DNA Sequenzierungstechniken und bioinformatische Methoden haben gezeigt, dass das genetische Potential von Streptomyces spp. Antibiotika zu produzieren noch nicht ausgeschöpft wurde. Eine große Anzahl an in biosynthetischen Genclustern (BGCs) organisierten Genen, die die enzymatische Maschinerie kodieren, die für die Produktion von antibiotisch wirksamen Sekundärmetaboliten notwendig ist, wird unter Laborbedingungen jedoch nicht exprimiert. Das Ziel dieses Projekts war es biosynthetische Gencluster für Sekundärmetabolite aus Streptomyces sp. Ru-355 und Streptomyces sp. Go-475, die aus in der äthiopischen Wüste gewonnenen Bodenproben isoliert worden waren, durch Genome Mining zu aktivieren um neue biologisch aktive Verbindungen zu entdecken. In einem ersten Schritt wurden die Bakterienstämme auf unterschiedlichen Nährmedien kultiviert um festzustellen welches Substrat am besten geeignet ist Sporenbildung zu induzieren. Danach wurden die Stämme verschiedenen Antibiotika ausgesetzt um sie auf mögliche Antibiotika Resistenzen zu untersuchen. Den Ergebnissen entsprechend konnte ein geeignetes Vektor Plasmid ausgewählt werden, das ein entsprechendes Resistenzgen enthielt. Dem folgte ein Pilotexperiment, im Zuge dessen das leere Vektor Plasmid in die Streptomyces Stämme konjugiert wurde. Anschließend wurden die bakteriellen Genome mithilfe der Genome Mining Software antiSMASH analysiert um BGCs zu identifizieren, die Gene enthalten, die der Lage sein könnten interessante biologisch aktive Verbindungen zu produzieren. Im weiteren Ablauf konnten regulatorische Gene innerhalb der BGCs lokalisiert werden, die möglicherweise die jeweiligen Cluster aktivieren. Anschließend wurden DNA Primer designt um diese regulatorischen Gene zu amplifizieren. Genomische DNA wurde isoliert und die regulatorischen Gene mittels PCR amplifiziert. Sowohl die PCR Produkte als auch das isolierte Vektor Plasmid wurden mit Restriktions-Enzymen geschnitten und anschließend ligiert um ein rekombinantes Vektor Plasmid für die Konjugation in die Streptomyces Stämme zu generieren. Die Vektoren wurden mittels Restriktions-Analyse verifiziert und in E.coli ET12567 transformiert um anschließend in Streptomyces sp. Go-475 konjugiert zu werden und dort den jeweiligen BGC zu aktivieren. Die rekombinanten Vektor Plasmide konnten nicht erfolgreich in Streptomyces sp. Go-475 konjugiert werden. Nach einer erfolgreichen Konjugation in Streptomyces albus J1074 wurden die rekombinanten Stämme in verschiedenen Medien fermentiert. Die methanolischen Extrakte aus diesen Medien wurden auf antibiotische Aktivität nach einer möglichen BGC Aktivierung untersucht. Nachdem eine antibiotische Aktivität gegen Bacillus subtilis detektiert werden konnte, wurde die relevanten Extrakte weiteren Anaylsen mittels HPLC und MS unterzogen um die produzierten antibiotischen Substanzen weiter aufzuklären und zu charakterisieren. Dies führte zur Identifikation neuartiger Derivate von Deferoxamin und eines weiteren Peptids.

Autor*innen

Michael Maier

Haupttitel (Englisch)

Activation of secondary metabolites biosynthetic gene clusters from Streptomyces strains isolated in the Ethiopian desert for discovery of new biologically active compounds

Paralleltitel (Deutsch)

Aktivierung von Sekundärmetaboliten Biosynthese-Gencluster aus in der äthiopischen Wüste isolierten Streptomyces-Stämmen zur Entdeckung neuer biologisch aktiver Verbindungen

Publikationsjahr

2022

Umfangsangabe

66 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Sergey Zotchev

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

AC Nummer

AC16482885

Utheses ID

62361

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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