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Effects of Roscovitine and Indirubin-derivatives on platelet derived growth factor signalling in vascular smooth muscle cells
Irene Sroka
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Verena Dirsch
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30010.29551.155069-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In der Pathogenese von Atherosklerose und Restenose spielen die abnorme Proliferation (Zellteilung) sowie Migration von glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC) eine große Rolle, indem beide Prozesse wesentlich zur Einengung von Blutgefäßen beitragen. Ein idealer Wirkstoff zur Bekämpfung von beiden Krankheitsbildern sollte sowohl die Proliferation als auch die Migration von VSMC verhindern. Ein wichtiger Stimulus für die Zellteilung und zugleich der stärkste Stimulus für die Migration von VSMC ist PDGF-BB (Platelet Derived Growth Factor-BB). Der Kinase Inhibitor Roscovitine (ROSC) zeigt eine erstaunliche Spezifität für Cyklin-abhängige Kinasen (CDKs). Darum wollten wir mit dieser Studie den genauen Mechanismus von ROSC auf PDGF-BB-stimulierte VSMC untersuchen und außerdem neue Derivate der Substanz testen. Wir untersuchten unterschiedliche ROSC Derivate auf ihre wachstumshemmenden Eigenschaften auf VSMC und stießen dabei auf eine vielversprechende Substanz, LGR1406, die eine bedeutend bessere Wirkung zeigte als die Ausgangsstruktur ROSC selbst. Wir fanden heraus, dass beide Substanzen die Proliferation von VSMC inhibieren ohne frühe Signaltransduktionswege im PDGF Signalling zu behindern. LGR1406 zeigte allerdings mit einem IC50 von 3 µM eine bedeutend bessere Wirkung als ROSC mit einem IC50 von 17 µM. Eine detaillierte molekulare Analyse mittels western blot und in vitro Kinase Assays zeigte dass beide Substanzen den Eintritt der Zelle in die S-phase des Zellzyklus behindern, ebenso die Expression von Cyclin A und E und die Phosphorylierung der Pocket Proteine Rb und p107. Allerdings konnten wir zeigen, dass ROSC selbst diese Vorgänge nur verlangsamt wohingegen LGR1406 die Zellen permanent in der G1 Phase des Zellzyklus arretiert. Als Ursache für die Wirkungen von beiden Substanzen vermuten wir die Inhibierung von CDKs durch ROSC und LGR1406. In weiterer Folge sind noch genauere Untersuchungen zum Wirkmechanismus und Tierstudien nötig, aber wir konnten mit dieser Studie erstmals zeigen, dass ROSC Derivate wie LGR1406 die Proliferation von VSMC verhindern können. Darum könnten solche Substanzen möglicherweise zur Beschichtung von Stents für die Therapie der Restenose weiterentwickelt werden.
Außerdem untersuchten wir den Einfluss von Indirubin-3'-monoxime (I3MO) auf PDGF-BB-induzierte Migration von VSMC. In unserer Gruppe konnte in vorangegangenen Studien gezeigt werden, dass I3MO die Proliferation von VSMC nach PDGF-BB Stimulierung verhindern kann. Ebenso konnte I3MO die Neointima-Bildung in einem Maus-Modell verringern. Zudem konnten wir zeigen, dass I3MO die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und die Aktivierung des Transkriptionsfaktors STAT3 verhindert ohne andere frühe Signaltransduktionswege zu beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wird nun gezeigt, dass I3MO die Migration von VSMC nach PDGF-BB Stimulierung dosisabhängig reduzieren kann und zwar im gleichen Dosisbereich wie es auch die Proliferation von VSMC hemmt. Außerdem konnten wir zeigen, dass I3MO frühe Umlagerungen des Zytoskeletts die mit der Migration von Zellen in Zusammenhang stehen verhindert und zwar ohne die Aktivierung des kleinen GTP-Proteins Rac-1 zu beeinträchtigen. Andererseits konnten wir eine Reduktion der Expression von STAT3 abhängigen Genen beobachten welche eine Rolle in der Migration spielen. Unsere Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass der anti-migratorische Effekt von I3MO möglicherweise vermittelt wird über die Reduktion von ROS und die daraus folgende Inhibierung von STAT3 vermittelt wird. Unsere Resultate untermauern, dass I3MO eine gute Substanz zur Behandlung vaskuloproliferativer Erkrankungen sein könnte. Aber noch sind weitere Studien zum Wirkmechanismus nötig.
Abstract
(Englisch)
Abnormal vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation and migration contribute to vascular narrowing during the pathogenesis of atherosclerosis and restenosis. An ideal compound for treating both diseases should therefore impair both proliferation and migration of VSMC. A major proliferative stimulus and the strongest chemoattractant for VSMC is the Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB). The kinase inhibitor roscovitine (ROSC) shows a high specificity for cyclin dependent kinases (CDKs) which are crucial for cell cycle progression. We therefore wanted to investigate the mode of action of ROSC and promising derivatives in PDGF-BB stimulated VSMC and define the changes in cell signalling. Screening a panel of synthetic ROSC derivatives for a general antiproliferative activity in VSMC we identified LGR1406 which showed significant higher potency than ROSC itself. We showed that LGR1406 and ROSC both inhibit proliferation of VSMC without affecting early signalling pathways downstream of the activated PDGF receptor. LGR1406 is hereby the far more potent compound with an apparent IC50 of 3.0 µM in the BrdU assay compared with an IC50 of 17 µM of ROSC. A detailed molecular analysis using western blot analysis as well as in vitro kinase assays showed that both compounds affect entry of cells into S-phase of the cell cycle, expression of cyclin A and E as well as phosphorylation of pocket proteins presumably by inhibition of CDK activity. However, ROSC only delayed these events whereas LGR1406 permanently blocked cell cycle progression in G1-phase of the cell cycle. We conclude that LGR1406 could be used for further development as e.g. stent coating agent but in vivo studies as well as further investigations on its molecular mechanism of action are needed.
Additionally we investigated the influence of Indirubin-3'-monoxime (I3MO) on PDGF-BB-induced migration of VSMC. In our group it had previously been shown that I3MO potently blocks VSMC proliferation in response to PDGF-BB and neointima formation in a mouse model (in vivo experiments were performed in cooperation with Prof. Binder, medical university of Vienna). Furthermore we had shown that it suppresses the production of reactive oxygen species (ROS) and the activation of the transcription factor STAT3, without interfering with other common early signalling events. In this study we now show that I3MO dose-dependently inhibits PDGF-BB-induced migration of VSMC in the same concentration range as it limits proliferation. Also we found that I3MO interferes with early cytoskeletal rearrangements involved in cell migration without affecting the small GTPase Rac-1. However, we found that I3MO reduced the expression of STAT3 target genes involved in migration. Our data suggest that the antimigratory effect of I3MO is probably mediated via the reduction of ROS production in the cell and consequent inhibition of STAT3 phosphorylation. Our studies further substantiate that I3MO is a promising compound for the treatment of vasculoproliferative diseases. But also here are some open questions regarding its molecular mechanism of action.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Platelet Derived growth factor Roscovitine Indirubin Vascular Smooth Muscle Cells Proliferation Migration LGR1406
Schlagwörter
(Deutsch)
Platelet Derived growth factor Roscovitin Indirubin Vaskuläre glatte Muskelzellen Proliferation Zell-Migration LGR1406
Autor*innen
Irene Sroka
Haupttitel (Englisch)
Effects of Roscovitine and Indirubin-derivatives on platelet derived growth factor signalling in vascular smooth muscle cells
Paralleltitel (Deutsch)
Effekte von Roscovitin und Indirubin-Derivaten auf Platelet Derived Growth Factor Signalling in vaskulären glatten Muskelzellen
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
160 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Malek Nisar ,
Ludger Hengst
AC Nummer
AC05040938
Utheses ID
6245
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |