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Mechanistic insight into endothelial cell dysfunction linked to cardiovascular disease in progeria

Christina Manakanatas

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (DissG: Molekulare Biologie)

Betreuer*in

Roland Foisner

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DOI

10.25365/thesis.75819

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-15743.31630.918636-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Herz-Kreislauf-Erkrankungen gehören weltweit zu den an den häufigsten auftretenden Todesursachen. Dies gilt insbesondere für alternde Gesellschaften. Bei Patient*innen, die unter dem Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom (HGPS) – einer Krankheit des vorzeitigen Alterns – leiden, treten Herz-Kreislauf-Erkrankungen schon in sehr jungen Jahren auf. HGPS wird durch eine einzelne De-novo-Punktmutation im LMNA-Gen verursacht, das für A-type Lamine (strukturelle Proteine im Zellkern) kodiert. Die altersbedingten Herz-Kreislauf-Erkrankungen, in gesunden so wie auch HGPS Patient*innen, gehen häufig mit einer Fehlfunktion des Endothels in den Blutgefäßen einher. Unter physiologischen Bedingungen ist das Endothel, das die Innenseite der Blutgefäße und der Herzkammern auskleidet, ein wichtiger Regulator des Gefäßtonus und der Homöostase. Unter pathologischen Bedingungen und im Zuge des Alterns sind die Endothelfunktionen jedoch beeinträchtigt, was oft zu Atherosklerose führt. In dieser Arbeit habe ich untersucht, ob und wie ein dysfunktionales Endothel auch zu HGPS-Pathologien beiträgt. In Zusammenarbeit mit meinen Kolleg*innen habe ich ein neues transgenes HGPS-Mausmodell entwickelt, das Progerin (die krankheitsverursachende Lamin Mutante) ausschließlich in vaskulären Endothelzellen exprimiert. Die transgenen Mäuse entwickeln viele HGPS-spezifische, kardiovaskuläre Pathologien, darunter linksventrikuläre Hypertrophie, linksventrikuläre diastolische Dysfunktion, interstitielle und perivaskuläre Fibrose, bis hin zum vorzeitigen Tod. Im Gegensatz zu gesunden Mäusen können die Endothelzellen unserer Mäuse nicht angemessen auf den durch den Blutstrom verursachten, mechanischen Stress reagieren, weil durch die Expression von Progerin die Mechanosignalübertragung beeinträchtigt wird. Im Atherosklerose-anfälligen Bereichen des Aortenendothels und in primären Endothelzellen konnten wir zudem einen gestörten Mechanokopplungs-Mechanismus zwischen Zellkern und Zytoskelett zeigen, der durch eine abnormale Lokalisierung und/oder verstärkte Expression von Stressreaktionsproteinen in der Kernhülle und einen Anstieg von fibrillären Actin hervorgerufen wird. Dadurch wird der Signalweg des „Myocardin-Related Transcription Factor A (MRTF-A)“ beeinträchtigt, was zu einer Reduktion von endothelialer Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) und Atherosklerose-vorbeugenden Stickstoffmonoxid (NO) im Blut führt. Zugleich induzieren die Endothelzellen auch eine parakrine, pro-fibrotische Wirkung im umliegenden Gewebe. Um weitere molekularen Defekte in Progerin-exprimierenden Endothelzellen zu identifizieren, haben wir genomweite mRNA- und micro-RNA (miR) Expressionsanalysen in primären Endothelzellen und im Plasma von Mäusen durchgeführt. Wir konnten dabei eine Hochregulierung des p53-verknüpften Seneszenz-Signalwegs und den Beginn eines Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP), einschließlich der Hochregulierung von zellulären und extrazellulären Seneszenz-assoziierten miRs zeigen. Pro-inflammatorische und pro-fibrotische miRs, miR34a-5p und miR31-5p waren sowohl in Endothelzellen, wie im Plasma hochreguliert. Zudem wurden miR133a-3p, miR21a-3p und miR582-5p in extrazellulären Vesikeln von Endothelzellen sekretiert. Erhöhte Werte von Seneszenz- und SASP-Markern, einschließlich miRs, wurden auch in Lungen- und Herzgewebe in vivo sowie in nicht-endothelialen Zellen und Geweben nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten In-vitro-Ko-kulturversuche, dass Endothelzellen durch parakrine Effekte Seneszenz und einen SASP-Phänotyp in Wildtyp-Fibroblasten induzieren können. Da miR34a-5p ein etablierter Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen ist, testeten wir seine funktionelle Bedeutung durch antagomiR-vermittelte Inhibierung von miR34a-5p und stellten dabei eine Reduzierung der Seneszenzmarker p53 und p16 fest. Die RNAi-vermittelte Ausschaltung von p53 reduzierte dagegen den Seneszenzmarker p21 und miR34a-5p sowie die pro-fibrotische Signalübertragung. Insgesamt schlagen wir auf Grundlage unserer Ergebnisse einen Krankheitsmechanismus vor, bei dem die Progerin-Expression im Endothel zu Defekten bei der Mechanosignalübertragung führt, was schlussendlich zur Induktion einer zellulären Seneszenz und des SASP Phänotyps führt. Ein komplexes Wechselspiel der p53- und miR34a-5p-Signalwege hält dabei den Seneszenz-Phänotyp der Endothelzellen aufrecht, wodurch parakrine Effekte induziert werden, die im umliegenden Gewebe Fibrose und entzündliche Reaktionen auslösen und zur kardiovaskulären Pathologie beitragen. Unsere Erkenntnisse sind von großer Bedeutung für die Identifizierung neuer diagnostischer und therapeutischer Mittel für HGPS und für andere altersbedingte, kardiovaskuläre Erkrankungen.

Abstract

(Englisch)

Cardiovascular diseases (CVDs) are among the most frequent deadly diseases worldwide in the aged population. CVDs are also prominent pathologies in patients suffering from Hutchinson Gilford Progeria syndrome (HGPS), a premature aging disease caused by a single point de novo mutation in the LMNA gene encoding nuclear lamin A and C. One of the key initiating events in the development of age-linked CVDs is a dysfunctional endothelium, which lines the inside of all blood vessel and the inner walls of the heart chambers. Under physiological conditions, the endothelium is a key regulator of vascular tone and homeostasis, but in pathological conditions and during aging endothelial functions are impaired, leading to downregulation of atheroprotective pathways. In this thesis I investigated, if and how a dysfunctional endothelium contributes also to HGPS pathologies. We generated a novel transgenic HGPS mouse model (Prog-Tg mice), expressing progerin - the disease-causing lamin A mutant – exclusively in vascular endothelial cells (Prog-Tg ECs). These mice develop many HGPS-related cardiovascular pathologies including premature death, left ventricular hypertrophy, left ventricular diastolic dysfunction and interstitial and perivascular fibrosis. Functionally, we detected an impaired shear stress response to blood flow in the atheroprone aortic endothelium and in primary endothelial cells (ECs) in vitro, and defects in mechanosignalling including impaired nucleocytoskeletal coupling, abnormal localization and /or increased expression of stress response proteins at the nuclear envelope and an increase of F-actin/G-actin ratio. Mechanistically we find that Prog-Tg ECs have an impaired myocardin-related transcription factor A (MRTF-A) signaling pathway leading to reduced levels of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and atheroprotective nitric oxide (NO). Prog-Tg ECs also initiated a paracrine pro-fibrotic effect to surrounding tissues. In order to get further insight into the cellular phenotype of progerin-expressing ECs we performed genome-wide mRNA and micro-RNA (miR) profiling in primary ECs, EC culture supernatants and in plasma of mice. These analyses revealed upregulation of the p53-linked senescence pathway and initiation of a senescence associated secretory phenotype (SASP), including upregulation of cellular and extracellular senescence-associated miRs. Specifically, pro-inflammatory and pro-fibrotic miR34a-5p and miR31-5p were found upregulated in Prog-Tg ECs as well as in plasma of Prog-Tg mice, and miR133a-3p, miR21a-3p and miR582-5p in EC-secreted extracellular vesicles. Interestingly, increased levels of senescence and SASP markers including miRs were also detected in lung and heart tissues in vivo, and in non-endothelial cells and tissues. Moreover, in vitro co-culture assays revealed that Prog-Tg ECs exert a paracrine senescence and SASP phenotype on co-cultured wildtype fibroblasts. Since miR34a-5p is an established CVD biomarker we tested its functional relevance for CVD by antagomiR-mediated inhibition of miR34a-5p and found reduced senescence markers p53 and p16. RNAi-mediated knockdown of p53 on the other hand reduced senescence marker p21 and miR34a-5p as well as pro-fibrotic signalling. Altogether, based on our findings we propose a disease mechanism, in which progerin-expression in the endothelium leads to mechanosignalling defects, in turn causing upregulation of-p53 linked senescence signalling and SASP in ECs, including senescence associated miRs (SA-miRs). p53 and miR34a-5p pathways work synergistically to initiate and maintain this complex senescence signalling network, and components of the SASP including secreted miRs in extracellular vesicles mediate a paracrine senescent and pro-fibrotic effect on non-endothelial cells and tissues and initiation of an inflammatory response. Our findings are highly relevant for the identification of novel diagnostic and therapeutic drugs for HGPS- and age-linked CVD.

Autor*innen

Christina Manakanatas

Haupttitel (Englisch)

Mechanistic insight into endothelial cell dysfunction linked to cardiovascular disease in progeria

Paralleltitel (Deutsch)

Mechanistische Einblicke in die Dysfunktion der Endothelzellen im Zusammenhang mit CVD bei Progerie

Publikationsjahr

2022

Umfangsangabe

109 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Herbert Stangl ,

Giovanna Lattanzi

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC16505897

Utheses ID

62485

Studienkennzahl

UA | 794 | 685 | 490 |

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Schlagwörter