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Studies on the role of the calcium binding mitochondrial carrier Aralar in development / differentiation / survival of mesencephalic dopaminergic neurons in mice

Katharina Gapp

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Monika Bradl

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DOI

10.25365/thesis.6950

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29830.91413.869062-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Aralar, ein mitochondrialler Aspartat /Glutamat Transporter, zählt zur Familie der Calcium mitochonriellen carrier und ist eine grundlegende Komponente des Malat-Aspartat NADH shuttle (MAS). Das Protein ist unerlässlich für eine einwantfreie Funktion der Mitochondrien[1]. Berücksichtigt man, dass differenzierende Neuronen einen erhöhten energetischen Aufwand haben, dass diese dadurch auch mehr ROS produzieren, welche die Mitochondrien einem größerem Stress aussetzten[2] and dass die MAS shuttle Funktion eventuell einen Einfluss hat auf die Fähigkeit der Neuronen sich zu differenzieren bzw. zu überleben[3], stellt sich die Frage ob Aralar möglicherweise eine Relevanz für Zelldifferenzierung beziehungsweise Zellüberleben hat. In dieser Diplomarbeit wurde der etwaige Einfluss von Aralar auf dopaminerge Neurogenese untersucht. Unter der Verwendung von Immunohistochemie in Cryostat Schnitten des ventralen Mesencephalons (VM), Immunocytochemie in Primärzellkultur des VM und mES Zellen und Western Blot Methoden, durchgeführt in CD1 Wildtyp Mäusen konnte eine abundante Aralar Expression während kritischer Phasen dopaminerger Neurogenese bestätigt werden. Vergleichende immunohistologische and immunocytochemische Studien des VM im embryonalen Alters von E11.5, E13.5, E14.5 und E15.5 von WT(+/+) und KO (-/-) Aralar Mäusen deckten Differenzen der quantitativen Ernte an dopaminergen Neuronen (erhoben anhand TH expression) und Unterschiede der Expression des dopaminergen Transkriptionsfaktors Foxa2, wie auch des Zellcyklus Marker Ki67 und des apoptotischen Markers Casp3 auf. Eine mögliche Erklärung wäre ein Einfluss von Aralar auf die Zellüberlebenskapazität auf Grund von fehlender mitochondrieller Integrität. Darüber hinaus könnte das Abhandenkommen der MAS shuttle Aktivität metabolische Veränderungen hervorrufen und dadurch die Transkriptionskontrolle der dopaminergen Neurogenese beeinflussen. Des Weiteren wurden mES Zelllinien durch aralar (+/-) Kreuzungen erzeugt und charakterisiert. Die Pluripotenz der Linien konnte durch Immunocytochemie und Cytochemie bestätigt werden. Genotypierung, antibiotische Selektion und Western Blot Analyse zeigten jedoch, dass keine Aralar defiziente Linie unter den hergeleiteten Linien war. Daraus wurde geschlossen, dass Aralar bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Entwicklung eine Rolle spielt, vielleicht auf Grund restringierter Energiebereitstellung durch defekte Mitochondrien. Aralardefizienz im Blastocystenstadium könnte deren Detektierung erschweren.

Abstract

(Englisch)

Aralar, a mitochondrial aspartate/glutamate carrier (AGC), belongs to the family of Calcium mitochondrial carriers (CaMC) and is a component of the malate-aspartate NADH shuttle (MAS). It has been shown essential for proper mitochondrial function [1]. Having in mind that differentiating neurons have increasing energetic demands, that differentiating neurons produce elevated levels of reactive oxygen species (ROS), which could expose mitochondria to an increased stress[2], and that the MAS shuttle function could be implied in differentiation and survival abilities of cells[3], the matter arises whether Aralar could be relevant for cell differentiation and/or survival capacity. In this thesis Aralar´s eventual role in dopaminergic neurogenesis was investigated. Expression studies, using immunohistochemistry of ventral mesencephalon (VM) cryostat slices, immunocytochemistry of ventral mesencephalic (VM) primary culture and mES cells and western blot methods, carried out in CD1 wildtype mice showed abundant Aralar expression during critical phases of dopaminergic neurogenesis. Comparative in vivo immunohistochemical and in vitro immunocytochemical expression studies of VM at embryonic ages E11.5, E13.5, e14.5 and E15.5 of WT(+/+) and KO (-/-) aralar mice revealed differences in dopaminergic neuron harvest (evaluated by tyrosine hydroxylase expression) and expression differences of Foxa2, a dopaminergic transcription factor, as well as the cell cycle marker Ki67 and the apoptotic marker casp3. Therefore an impact of Aralar on cell survival capacity due to missing mitochondrial integrity is suggested. Furthermore MAS shuttle activity deprivation could explain metabolic changes which could influence transcriptional control of dopaminergic neurogenesis. Moreover mES cell lines from aralar (+/-) mates have been established and characterised. Pluripotency of established lines has been approved by immunocytochemistry and cytochemistry. Still genotyping, antibiotic selection and western blot analysis demonstrated that no ara (-/-) mES cell line could be derived. This lead to the conclusion that Aralar might already be implicated at a very early point of development maybe because of restricted energy supply. Aralar deficiency at blastocyst stage might difficultate their detection.

Autor*innen

Katharina Gapp

Haupttitel (Englisch)

Studies on the role of the calcium binding mitochondrial carrier Aralar in development / differentiation / survival of mesencephalic dopaminergic neurons in mice

Paralleltitel (Deutsch)

Studien über die Rolle des Calcium bindenden mitochondirellen Carrier Aralar in Entwicklung / Differenzierung / Überleben von mesenzephalischen Neuronen in Mäusen

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

78 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Monika Bradl

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC08116396

Utheses ID

6280

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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Schlagwörter