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Functionalized liposomes as a model to reveal cell-surface associated events of the human rhinovirus infection-pathway

Gerhard Bilek

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Ernst Kenndler

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DOI

10.25365/thesis.6951

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30471.81116.215965-7

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Der virale Genomtransfer im Infektionszyklus von nicht-umhüllten Viren ist bisher nur ansatzweise erforscht. Diese Arbeit soll zum besseren Verständnis des Transfermechanismus beitragen und bedient sich des humanen Rhinoviruses (HRV) als Repräsentant dieser Viren. Diese enthalten ein 7 kb RNA-Genom, verkapselt in einer ikosaedrischen Proteinhülle – dem Kapsid. Um die Wirtszelle zu infizieren, muss das Genom durch die endosomale Membran in das Zytoplasma befördert werden. Die essentiellen viralen und zellulären Elemente für den Transfer sollen mit dieser Arbeit - in einem in-vitro Ansatz - detektiert werden. Anstelle von lebenden Zellen mit nativen Rezeptoren fanden Liposome als Modellzelle Einsatz. Die Liposome wurden mit rekombinanten Rezeptorfragmenten bestückt, die dem „very low-density lipoprotein“ Rezeptor entstammten. Über ihr C-terminales His6-Tag konnten sie an ein Nickel-komplexierendes Lipid der Liposomoberfläche gebunden werden. Nach der spezifischen Bindung von HRV Serotyp 2 (HRV2) an diese Rezeptoren der Liposomoberfläche war der resultierende Komplex für eine potentielle Infektion präpariert; er wurde daher „Lipofektosom“ genannt. Die Eignung dieses Modells konnte mittels Kapillarelektrophorese (CE) und Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) bestätigt werden. Der Nachweis des Genomtransfers erfolgte mit einem revers-transkribierenden (RT) PCR System. Die Parameter für die korrekte Assemblierung des Lipofektosoms wurden mittels CE mit laser-induzierter Fluoreszenz-Detektion und TEM-Visualisierung optimiert. Letztere Technik ermöglichte Screening von Proben im schwach sauren Medium zur Feststellung der Bedingungen für den vollständigen RNA-Transfer. Um das Eindringen des RNA-Genoms in das Innere des liposomalen Kompartiments zu bestimmen, wurde ein Protokoll zur RT hinsichtlich seiner Anwendung im Lipofektosom adaptiert. Dadurch konnte anhand eines Lipofektosoms gezeigt werden, dass mit dem Auslösen der Infektion die virale RNA vom Kapsid in das Liposom migrierte; dort konnte sie tatsächlich via RT und PCR detektiert werden. Die Dichtheit des liposomalen Kompartiments stellte eine Grundvoraussetzung für das Funktionieren des verkapselten RT-Kits dar; man kann es somit als Nano-Reaktionscontainer betrachten. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die hier entwickelte in-vitro Methode geeignet ist, den RNA-Transfer nicht-umhüllter Viren zu detektieren. Diese Arbeit demonstrierte am Beispiel des Genomtransfers von HRV2, dass komplexe Infektionsprozesse in diskrete und simple Einzelprozesse aufgelöst werden können.

Abstract

(Englisch)

Viral genome transfer through cellular membranes is a crucial process in the course of early infection events of non-enveloped viruses. It is the aim of this work to contribute to a better understanding of this mechanism taking human Rhinoviruses as typical representative of this virus type. They contain an RNA genome of about 7 kb in an icosahedral protein capsid, which needs to be transferred through the endosomal membrane to infect the host cell. This work aimed at detecting in-vitro the essential viral and cellular elements for proper genome transfer. Instead of using natural cells with native receptors, the liposome-based model used a nickel chelating lipid for attaching His6-tagged receptor constructs, derived from the very low-density lipoprotein receptor (VLDLR). Upon specific binding of HRV2, the assembly was primed for infection, and thus called “lipofectosome”. The suitability of this model was confirmed by capillary electrophoresis (CE) and transmission electron microscopy (TEM). Finally, proper genome transfer could be demonstrated by a reverse transcription (RT) PCR assay. Parameters for assembly were optimized by CE with laser-induced fluorescence (LIF) detection and TEM imaging. The latter technique enabled screening of samples kept in moderately acidic environment to identify conditions for entire RNA release. To confirm the ingress of released RNA into the liposomal compartment, an RT protocol was adapted to allow for its application within lipofectosomes. It was shown that upon triggering infection, lipofectosomes transferred the RNA from within the virion into the interior of the vesicle; their viral RNA was detected via RT and PCR. Since liposomes served here as leak-tight compartment to carry out RT, they can be considered as nano-reaction containers. In conclusion, a system to monitor in-vitro the RNA transfer of non-enveloped viruses was invented. This work shows that even complex infection pathways can be resolved to discrete and plain processes, such as the genome transfer.

Autor*innen

Gerhard Bilek

Haupttitel (Englisch)

Functionalized liposomes as a model to reveal cell-surface associated events of the human rhinovirus infection-pathway

Paralleltitel (Deutsch)

Funktionalisierte Liposome als Modell zur Aufklärung von Zelloberflächenereignissen während des Infektionsprozesses von humanen Rhinoviren

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

Getr. Zählung : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Václav Kasicka ,

Karin Stiasny

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften

AC Nummer

AC07452260

Utheses ID

6281

Studienkennzahl

UA | 091 | 441 | |

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Schlagwörter