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Binding of cohesin to nucleosome-bound DNA
Tabea Gruber
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Jan-Michael Peters
DOI
10.25365/thesis.71602
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-16917.65802.302646-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Cohesin ist eine ringförmige DNA-bindende ATPase und gehört zur SMC Protein Familie. Ursprünglich wurde Cohesin für seine Funktion im Zusammenhalt der Schwesterchromatiden entdeckt, doch in den letzten Jahren wurde Cohesin’s Fähigkeit in Genomfaltung erforscht. Um das Genom in „Loops“ und „TADs“ zu falten muss Cohesin entfernte DNA-Sequenzen in cis über einen Vorgang verbinden, der sich „Loop Extrusion“ nennt. „Loop Extrusion“ wurde in vitro beobachtet, aber wie dieser Vorgang in vivo funktioniert ist weiterhin unklar, da in lebenden Zellen DNA nicht nackt vorliegt, sondern von Proteinen, hauptsächlich Nukleosomen, bedeckt ist. Nukleosomen kompaktieren DNA damit das Genom in den Zellkern passt. Nukleosom-gebundene DNA ist für die meisten Proteine nicht zugänglich und kann daher für Cohesin’s Funktion an DNA ein Hindernis sein. In dieser Arbeit wird die Bindung von Cohesin und seinem HAWK-Protein NIPBL an Nukleosom-gebundene DNA und freie „linker-DNA“ beobachtet. Dafür werden EMSAs, Massenphotometrie und HS-AFM Experimente verwendet. Rekombinante Proteine werden in Sf9 Zellen exprimiert und über „Tandem Affinity Purification“ aufgereinigt. Zwei verschiedene Typen von Nukleosomen werden mit Hilfe von Sf9 Histonen rekonstituiert: Nukleosomen die 147 bp DNA enthalten und keine freie DNA haben, und Nukleosomen die 202 bp DNA und daher freie hervorstehende DNA enthalten. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass Cohesin freie DNA braucht, um seine Funktion in lebenden Zellen auszuüben. Zusätzlich scheint es, als könnte NIPBL an Nukleosom-gebundene DNA binden, aber ob es somit auch Cohesin an Nukleosom-gebundene DNA laden kann, und ob es diese Funktion auch in vivo ausführen kann, bleibt unklar und erfordert weitere Forschung.
Abstract
(Englisch)
Cohesin, a ring-shaped DNA-binding ATPase, is a member of the SMC protein family that was originally discovered for its importance in sister chromatid cohesion. In recent years cohesin’s function in genome folding, where it forms DNA loops and TADs, has been discovered. To fold the genome in interphase cells cohesin connects distal DNA sequences in cis through a process called loop extrusion, which was observed in vitro. How cohesin can perform this function in vivo is still unknown. One of the questions that remain is how cohesin performs loop extrusion not on free but decorated DNA, including nucleosomes. Nucleosomes fold and compact DNA so that large genomes fit into the cell nucleus. Nucleosome-bound DNA is not accessible to most proteins and therefore might be an obstacle for cohesin’s function on DNA. In this study binding of cohesin and NIPBL to nucleosome-bound DNA or free linker-DNA is observed using EMSAs, mass photometry and HS-AFM. To do this, recombinant proteins are expressed in Sf9 cells and purified using tandem affinity purification. Furthermore, two types of nucleosomes are reconstituted using Sf9 histones and 147 bp of DNA, containing no protruding DNA, or 202 bp of DNA, resulting in free linker-DNA protruding from the nucleosome. The results of this study indicate that cohesin needs free accessible DNA to perform its function on chromatin. Furthermore, NIPBL seems to be able to interact with nucleosome-bound DNA but whether it can load cohesin onto nucleosome-bound DNA and if it can perform this function in vivo remains unanswered.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Cohesin Nukleosomen NIPBL EMSAs Massenphotometrie HS-AFM Genomorganisation
Schlagwörter
(Englisch)
cohesin nucleosomes NIPBL EMSAs Mass Photometry HS-AFM genome organization SMC proteins
Autor*innen
Tabea Gruber
Haupttitel (Englisch)
Binding of cohesin to nucleosome-bound DNA
Paralleltitel (Deutsch)
Bindung von Cohesin an Nukleosomen-gebundene DNA
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
viii, 52 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Jan-Michael Peters
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC16567449
Utheses ID
63184
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |