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Misexpression of Pax2 during midbrain development of chick
Wilhelm Ludwig
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Erwin Heberle-Bors
DOI
10.25365/thesis.6993
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29707.40927.193763-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Verschiedene molekulare Mechanismen steuern die Differenzierung und
Ausbildung von Zellmustern im Neuralrohr entlang der anteroposterioren
Achse. Transplantationsstudien im Huhn zeigten, dass ein autonomes
Organisationszentrum an der Grenze zwischen Met- und
Mesencephalon existiert, welches interessant für die Erforschung der
Mechanismen der Zelldifferenzierung und der involvierten Gene ist. Um
unbekannte Targetgene von bekannten regulatorischen Faktoren zu
identifizieren, entwickelten wir ein System, bei dem die Missexpression
eines zu untersuchenden Proteins durch Dimerisierung mittels
Rapamycin induziert werden konnte. Die Experimente wurden an
Hühnerembryos durchgeführt und die DNA mittels Elektroporation in die
gewünschte Region eingeschleust. Mittels dieses Systems waren wir in
der Lage die Missexpression an einem spezifischen Ort und im
gewünschten Entwicklungsstadium zu induzieren. Um direkte
Targetgene zu identifizieren, wurde der Translationsinhibitor
Cycloheximid (CHX) verwendet, wodurch die Translation der mRNA der
Targetgene unterbunden wurde. Dieses System wurde mit
unterschiedlichen Expressionskonstrukten getestet. FgfFK ist ein
Fusionsprotein aus dem Fgf-Rezeptor und der Rapamycin bindenden
FK-Domäne, welches durch induzierbare Dimerisierung aktiviert werden
konnte. Das PDFK-FR65-System wiederum bestand aus zwei
Plasmiden. Eines kodierte für die DNA-bindende „Paired domain“-Region
des Transkriptionsfaktors Pax2, fusioniert mit der Rapamycin/Rapalog
bindenden FK-Domäne, das andere für die Rapalog bindende FRDomäne,
fusioniert mit dem transaktivierenden Bereich des p65-Gens.
Das pMCPDVP16 Expressionskonstrukt enthielt den gesamten
Transkriptionsaktivator auf einem Plasmid. Mit dem induzierbaren FgfFKSystem
konnten wir, mittels In-situ-Hybridisierung, nachweisen, dass der
Fgf-Rezeptor die Expression des Gens Pea3 aktiviert. Keine
Veränderung konnte im Expressionsmuster von Spy1 beobachtet
werden. Mit pMCPDVP16 elektroporierte Embryos zeigten in dieser
Region hohe Mengen an Pax5 mRNA. Da PDVP16 dieselbe DNAbindende
Domäne enthält wie Pax2, ist es wahrscheinlich, dass Pax5 ein
direktes Targetgen von Pax2 ist. Sowohl bei mit FgfFK, als auch bei den
mit PDVP16 elektroporierten Embryos, verschwand auf der Seite, auf
der die Missexpression stattfand, das metencephalische Vesikel. Bei
Elektroporation mit Bluescript-Kontroll-DNA wurde dies nicht beobachtet,
was darauf hinweist, dass es sich nicht um ein Artefakt handelt. Der
Mechanismus, der dies verursacht, bleibt zu untersuchen.
Abstract
(Englisch)
Several molecular mechanisms control the patterning and differentiation
of the neural tube along the anteroposterior axis. Early transplantation
experiments in chicken showed that there is an autonomic organizing
centre in the mid/hindbrain boundary that is highly interesting for the
investigation of the mechanisms of cell differentiation and the genes that
induce it. In order to identify unknown target genes of known regulatory
proteins, we developed a system which is able to activate misexpression
by Rapamycin mediated dimerization of the proteins of interest. The
experiments were performed on chick embryos and the DNA was
introduced into the desired region by electroporation. This system
allowed us to turn on misexpression in a specific region and
developmental stage. In order to determine the direct target genes we
used the translation inhibitor Cycloheximide (CHX) so that no further
translation could occur after the putative primary target genes were
activated and the mRNA synthesized. We tested this system with
different proteins. The FgfFK is a fusion protein of the Fgf-receptor and
the Rapamycin binding FK domain which is activated by induced
dimerisation. The PDFK-FR65 System consists of two plasmids, one
encoding the DNA binding “Paired domain” of the transcriptional activator
Pax2 fused to three Rapamycin/Rapalog binding FK domains, the other
one encoding a fusion protein of the Rapalog binding FR domain fused
to the transactivation domain of the p65 gene. Finally the pMCPDVP16
system, were the whole transcriptional activator is encoded in one
plasmid. With the Rapamycin inducible Fgf-receptor (FgfFK) we could
show by “in situ” hybridisation with Pea3 RNA probes that the Pea3 gene
is activated by the Fgf-receptor. We didn’t see any alteration in Spy1
expression pattern. Embryos electroporated with pMCPDVP16 showed
high amounts of Pax5 mRNA at the electroporated region. It is very likely
that PDVP16 activates Pax5 transcription. PDVP16 contains the same
DNA binding domain as Pax2, so it is also very likely that Pax2 has the
same effect. PDVP16 as well as the dimerized Fgf-receptor cause
disappearance of the metencephalic brain vesicle at the side where
these two genes were misexpressed. Embryos electroporated with
Bluescript control DNA did not show this effect. This indicates that it is
not an artefact, but a consequence of misexpression of PDVP16 and
Fgf-receptor activation. The exact mechanism, that causes this effect,
remains to be investigated.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Pax2 Fgf8 target genes midbrain misexpression chick
Schlagwörter
(Deutsch)
Pax2 Fgf8 Targetgene Mittelhirn Missexpression Huhn
Autor*innen
Wilhelm Ludwig
Haupttitel (Englisch)
Misexpression of Pax2 during midbrain development of chick
Paralleltitel (Deutsch)
Missexpression von Pax2 während der Mittelhirnentwicklung beim Huhn
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
59 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Erwin Heberle-Bors
AC Nummer
AC08164582
Utheses ID
6323
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |