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Structural and functional studies of Trypanosoma brucei flagellar pocket collar protein BILBO421 and Saccharomyces cerevisiae SNARE-associated proteins Sso1/2 and Sec3
Maximilian Alexander Peer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Gang Dong
DOI
10.25365/thesis.71692
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-26373.65813.766759-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die folgende Arbeit beleuchtet zwei Themen. Der erste Teil nimmt sich der Struktur und Funktion des Trypanosoma brucei „Flagellar Pocket Collar“ (FPC, dt. Geißeltaschenkragen) Proteins BILBO421 an. Trypanosoma brucei, ein unizellulärer, protozoischer Parasit der Trypanosomatidae Familie, ist der Erreger der Afrikanischen Trypanosomiasis. Seine Zelle besitzt ein charakteristisches Flagellum, welches aus einer birnenförmigen Einstülpung am posterioren Ende, der Geißeltasche, hervorragt. Die Geißeltasche, der einzige Ort der Endo- und Exozytose, wird durch eine Einstülpung der Zellmembran geformt und durch eine hufeisenartige Struktur, dem FPC, zusammengehalten. Das Protein BILBO1 war die erste identifizierte Komponente des FPCs. Es ist Teil des Zytoskeletts und formt eine gürtelartige Struktur, welche den Hals des FPCs umringt. Diese gürtelartige Struktur wird durch den Zusammenbau von einzelnen BILBO1 Molekülen über ihre „Coiled-Coil“-Domäne zu antiparallelen Dimeren erreicht, wobei diese Dimere sich wiederum über eine C-terminale „Leucine- Zipper“-Domäne des Proteins zu theoretisch unbegrenzt langen, filamentösen Strukturen zusammenschließen. Eine weitere bestätigte Komponente des FPCs, nebst BILBO1, ist das Protein FPC4. Dem Protein, welches die Fähigkeit besitzt Mikrotubuli zu binden, wurde nachgewiesen mit der N-terminalen Domäne (NTD) BILBO1s über seine C-terminalen Domäne (CTD) zu interagieren. Computergestützte Untersuchungen haben vier weitere Proteine identifiziert, welche eine BILBO1 homologe NTD besitzen. Einem dieser Proteine, FPC3/BILBO2, konnte ebenfalls eine Interaktion mittels seiner NTD mit der CTD FPC4s nachgewiesen werden. In dieser Arbeit konnte dem Protein BILBO421, einem dieser vier identifizierten Proteine, nachgewiesen werden, dass es die Fähigkeit BILBO1s und FPC3/BILBO2s teilt, mit der CTD FPC4s zu interagieren. Zusätzlich konnte die Anwendung von Rotationsschatten-Elektronenmikroskopie (rsEM) nachweisen, dass BLBO421, ähnlich zu BILBO1, antiparallele Dimere ausbildet. Ebenso konnte nachgewiesen werden, dass die EF-Hand Motive BILBO421s, in Gegenwart von Ca2+-Ionen, die Struktur des Proteins beeinflussen können, so wie es schon bei BILBO1 beobachtet wurde.
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Der zweite Teil der Arbeit widmet sich der Interaktion der Saccharomyces cerevisiae SNARE-assoziierten Proteine Sso1/2 und Sec3. Zum Zwecke der Exozytose in Hefen ist die Vesikel-Andockstelle durch einen oktameren „Exocyst“-Komplex markiert. Dieser Bindungs-Faktor fängt sekretorische Vesikel ein und bringt diese zum Ort der Exozytose. Um die Exozytose zu vollziehen, müssen die zwei „t-SNARE“ Proteine Sso1/2 und Sec9 der Zielmembran mit den „v-SNARE“ Proteinen des Vesikels interagieren. Sso1/2 besteht aus vier Helices, den ersten drei (Habc), welche die inhibitorische Domäne bilden, und H3, dem SNARE-Motiv, welches mit den SNARE Proteinen Sec9 und Snc1/2 während der Membranfusion interagiert. Sec3, Teil des Exocyst-Komplexes besteht aus einer N-terminalen „Pleckstrin Homology“-Domäne (PH), einer zentralen Coiled-Coil-Domäne und einer C-terminalen helikalen Domäne. Die Sec3 PH Domäne regt Konformationsänderungen innerhalb des aus vier Helices bestehenden Bündels von Sso2 an, was zur Abspaltung der H3-Domäne von der inhibitorischen Domäne führt. Dies erlaubt wiederum die Bildung eines initialen binären Komplexes zwischen H3 Sso2s und den zwei Helices Sec9s, was diesem neugebildeten Komplex wiederum ermöglicht, mit dem v-SNARE Protein Snc1/2 zu interagieren und so die Membranfusion anzustoßen. Eine neue Proteinstruktur des Sec3/Sso2 Komplexes deckt nun eine weitere Bindungsstelle für Sec3 auf Sso2 auf. Diese Bindungsstelle ist am N-terminalen Ende Sso2s lokalisiert und bestehend aus zwei hoch-konservierten Asn-Pro-Tyr (NPY) Motiven. Diese neuen NPY-Motive sind mit dem helikalen Kern Sso2s mittels einem langen und flexiblen „Linker“ verbunden. Die Kristallographischen Daten legen nahe, dass diese NPY-Motive ähnlich einem Angelhaken agieren und somit die Rekrutierung des Sso2 t-SNARE Proteins zur Vesikel-Andockstelle steigern. Die Proteinstruktur dieser neuen noch unveröffentlichten kristallographischen Daten, besteht aus zwei heterodimeren Komplexen, welche jeweils zeigen, wie eines der NPY-Motive in einer konservierten hydrophoben Tasche auf der Oberfläche Sec3s bindet. Mittels isothermer Titrationskalorimetrie konnte in dieser Arbeit nicht nur nachgewiesen werden, dass beide NPY-Motive die Fähigkeit besitzen Sec3 zu binden, sondern, dass dieses auch synergetisch geschieht. Die Ergebnisse der isothermen Titrationskalorimetrie konnten weitreichend durch mehrere in vivo Experimente gestützt werden.
Abstract
(Englisch)
This study focuses on two topics. The first part focuses on the structure and function of Trypanosoma brucei flagellar pocket collar protein BILBO421. Trypanosoma brucei is a unicellular protozoan parasite of the Trypanosomatidae family and cause of the vector-borne disease Human African trypanosomiasis. The cell features a distinctive flagellum, which emerges from a bulb-like invagination at the posterior end of the cell, the flagellar pocket (FP). The FP is formed by invagination of the cells membrane and is held in place by a horseshoe-like structure, the flagellar pocket collar (FPC). The FP is the sole site of endo- and exocytosis. Protein BILBO1 was the first component of the FPC to be identified. BILBO1 is a multi-domain cytoskeletal protein proposed to form a belt-like solenoid structure circling the flagellar pocket neck. This solenoid structure is achieved by assembly into antiparallel homodimers, via its coiled-coil domain, which themselves are linked to long filamentous structures, via their C-terminal leucine-zipper domain, forming a filament of potentially indefinite length. Another confirmed FPC component, besides BILBO1, is FPC4. FPC4 is a is a microtubule-binding protein. FPC4 has been found to interact with BILBO1 via its C-terminal region. Computational studies have shown that four BILBO1-like proteins share a similar NTD. One of these BILBO1-like proteins, FPC3/BILBO2, was found to also bind the C-terminal region of FPC4 via its NTD. In this study BILBO421, being one those four identified proteins, has been found to shares the ability of BILBO1 and FPC3/BILBO2 to interact with the C-terminal domain of FPC4. Further, rotary shadowing electron microscopy imaging unveiled that BILBO421 forms antiparallel dimers, as previously observed in BILBO1. The ability of the BILBO421 EFh-motifs to alter the proteins conformation, as seen in BILBO1, could be verified as well.
The second part of the study focuses on the interaction of Saccharomyces cerevisiae SNARE-associated proteins Sso1/2 and Sec3. For exocytosis in yeast, the vesicle docking site is marked by an octameric complex called the exocyst. This tethering factor captures and brings secretory vesicles to the site of exocytosis. To facilitate exocytosis, two t-SNARE proteins of the target membrane, Sso1/2 and Sec9, must interact with the v-SNARE protein Snc1/2 of the vesicle. Sso1/2 consists of four helices (Habc & H3), with the first three (Habc) forming an inhibitory domain and H3 as the SNARE motif to interact with Sec9 and Snc1/2 during membrane fusion. Sec3, part of -5-
the exocyst complex consists of a N-terminal pleckstrin homology domain (PH), a central putative coiled-coil, and a C-terminal helical domain. The Sec3 PH domain promotes conformational change in the four-helix-bundle of Sso2, releasing H3 from the inhibitory domain, allowing the formation of an initial binary complex between H3 of Sso2 and the two helices of Sec9. Thus, allowing this newly formed complex to interact with the v-SNARE Snc1/2 to facilitate membrane fusion. A new crystal structure, of the Sec3/Sso2 complex revealed an additional binding site for Sec3 on Sso2, located at the N-terminal end of Sso2, comprised of two highly conserved Asn- Pro-Tyr (NPY) motifs. These two NPY motives are connected to the helical core of Sso2 via a long flexible linker. The data suggests that the NPY motifs act like a fishing hook, enhancing recruitment of the Sso2 t-SNARE protein to the vesicle targeting site. The crystal structure revealed two distinct heterodimeric complexes, each showing one of the two NPY motifs to be bound to a conserved hydrophobic pocket on Sec3 respectively. Via an isothermal titration calorimetry assay this study was not only able to show, that either of the NPY-motifs are able to bind Sec3, but also that the NPY- motifs bind Sec3 synergistically. The results obtained by the isothermal titration calorimetry assay could be largely confirmed by extensive in vivo assays.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
PFC BILBO421 Sso Sso2 Sec3
Schlagwörter
(Englisch)
PFC BILBO421 Sso1 Sso2 Sec3
Autor*innen
Maximilian Alexander Peer
Haupttitel (Englisch)
Structural and functional studies of Trypanosoma brucei flagellar pocket collar protein BILBO421 and Saccharomyces cerevisiae SNARE-associated proteins Sso1/2 and Sec3
Paralleltitel (Deutsch)
Strukturelle und funktionelle Analyse des Trypanosoma brucei Geißeltaschenkragenproteins BILBO421 und der Saccharomyces cerevisiae SNARE-assoziierten Proteine Sso1/2 und Sec3
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
122 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Gang Dong
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC16583606
Utheses ID
63271
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |