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Approaches to generate axenic Limnospira fusiformis cultures and a comparison of methods to verify axenicity
Leo Pokorny
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Microbiology, Microbial Ecology and Immunobiology
Betreuer*in
Michael Schagerl
DOI
10.25365/thesis.71804
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-26378.80342.441146-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Eine axenische Kultur beschreibt eine Kultur, in der nur ein einziger Stamm und keine weiteren Organismen nachweisbar sind. Die notwendige Aufreinigung hierfür ist äußerst zeit- und arbeitsaufwändig. Über die Jahre wurden zu diesem Thema zahlreiche Strategien veröffentlicht. Das filamentöse Cyanobakterium Limnospira ist eine wirtschaftlich äußerst bedeutende Mikroalge und daher im Fokus aktueller Forschung. Wir untersuchten Methoden, um eine axenische Kultur eines Limnospira fusiformis Stammes aus dem Nakuru See in Kenia zu generieren. Eine bereits etablierte Strategie, bestehend aus einer Serie unterschiedlicher Behandlungen, wurde hierfür angewandt. Die Strategie umfasst Waschschritte (am Filter), die Kultivierung in Medium mit erhöhtem pH-Wert, β-Lactam-Antibiotikabehandlungen und eine abschließende Verdünnungsreihe. Zusätzlich wurden modifizierte Varianten dieser Strategie getestet. In einer der modifizierten Testreihen wurde eine Ultraschall-Behandlung hinzugefügt, in einer weiteren wurde das Antibiotika-Spektrum erweitert. Der zweite Fokus dieser Arbeit lag darin, vier unterschiedliche Methoden zur Verifizierung axenischer Bedingungen zu testen und im Anschluss zu vergleichen. Hierfür wurden Durchflusszytometrie, Epifluoreszenzmikroskopie, LB-Agar Plattentests und 16S rRNA-Gen Amplikon-Sequenzierung angewandt. Eine axenische Kultur konnte letztlich nicht generiert werden, jedoch konnten die Behandlungen die Abundanz der Kontaminanten und die Anzahl unterschiedlicher kontaminierender Taxa signifikant senken. Wir zeigten, dass der klassische LB-Agar Plattentest eine ungeeignete Methode der Verifizierung axenischer Bedingungen darstellt, da auch Plattentests deutlich kontaminierter Kulturen keinerlei koloniebildende Einheiten aufwiesen. Zellzählungen durch Durchflusszytometrie und Epifluoreszenzmikroskopie zeigten ein lineares Verhältnis, wobei die Durchflusszytometrie stets höhere Zählungen generierte. Die 16S rRNA-Gen Amplikon-Sequenzierung zeigte sich als effizientes Werkzeug zur Verifizierung axenischer Bedingungen und gleichzeitig als Möglichkeit, überlebende Kontaminanten zu identifizieren.
Abstract
(Englisch)
Axenicity is defined as the state of a culture with only a single strain present, free of any other organism. Obtaining axenic cultures can be tough and many strategies have been developed over the years. We searched for methods to generate axenic cultures of Limnospira fusiformis, which is commercially exploited and which shows a constantly increasing market value. We applied filtration-washing, increased pH, β-lactam antibiotics and dilution series, which are established treatments. Furthermore, we tested modified versions of this approach by adding an ultrasonication step and by expending the antibiotics cocktail. In addition, we assessed techniques to verify axenicity and highlighted their advantages and disadvantages. Flow cytometry, 16S rRNA gene amplicon sequencing, tests on LB-agar-plates and epifluorescence microscopy were compared. Even if we could not achieve an axenic culture, our treatments were able to significantly reduce the abundance and taxa richness of contaminants. We found the classic LB-agar-plate test as inappropriate to verify axenicity in L. fusiformis. Plate tests did not indicate any contamination, contrarily to the other methods applied. We found a linear relationship between total cell counts of contaminants achieved by flow cytometry and epifluorescence microscopy, with flow cytometry counts being consistently higher. 16S rRNA gene amplicon sequencing demonstrated its superiority by not only being an efficient tool for axenicity-verification, but also for identification of persistent contaminants.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Antibiotika Arthrospira Axenische Kulturen Durchflusszytometrie Aufreinigung Spirulina Ultraschallbehandlung
Schlagwörter
(Englisch)
Antibiotics Arthrospira Axenic cultures Flow cytometry Purification Spirulina Ultrasonication treatment
Autor*innen
Leo Pokorny
Haupttitel (Englisch)
Approaches to generate axenic Limnospira fusiformis cultures and a comparison of methods to verify axenicity
Paralleltitel (Deutsch)
Herstellung axenischer Limnospira fusiformis Kulturen und Methodenvergleich zur Verifizierung von Axenie
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
42 Seiten
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Michael Schagerl
AC Nummer
AC16590276
Utheses ID
63545
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |