Detailansicht

Selective and accurate translation by protein-depleted ribosomes formed in E. coli in the presence of kasugamycin in vivo

Lena Sokol

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Udo Bläsi

Volltext herunterladen
Volltext in Browser öffnen

DOI

10.25365/thesis.7029

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29059.91097.845163-9

Link zu u:search

(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Kasugamycin ist ein Antibiotikum aus der Klasse der Aminoglycoside. Es inhibiert die Ausbildung des Translationsinitiationskomplexes an kanonischen mRNAs, indem es die Bindung der mRNA in der ribosomalen P-Stelle blockiert. Im Gegensatz dazu inhibiert es aber nicht die Initiation der Translation von sogenannten „leaderless mRNAs“, die direkt mit einem 5´-terminalem Startcodon beginnen und somit keine zusätzlichen Startsignale für das Ribosom aufweisen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass in E. coli in Anwesenheit von Kasugamycin Ribosomen gebildet werden, denen einige Proteine der 30S Untereinheit fehlen. Zu den fehlenden Proteinen gehören unter anderem die essentiellen Proteine S1 und S2, und das Protein S12. Da bekannt ist, dass Kasugamycin –im Gegensatz zu anderen Aminoglycosiden- keinen Einfluss auf die Fehlerrate hat und nicht zu einer Verschiebung des Leserahmens während der Translation führt, könnte das Fehlen von S12, das die Translationsgenauigkeit des Ribosoms negativ beeinflusst, ein Hinweis darauf sein, dass die protein-defizienten Partiklen eine höhere Genauigkeit in der Translation aufweisen. Daher war das erste Ziel meiner Arbeit, diese Hypothese zu bestätigen. Mit Hilfe von „leaderless“ GFP-Konstrukten würde die Translationsgenauigkeit in vivo nach Zugabe von Kasugamycin bestimmt. Die Resultate deuten darauf hin, dass die Fehlerrate der ribosomalen Partikel im Vergleich zu vollständig assemblierten Ribosomen geringer ist. Vorangegangene Experimente haben gezeigt, dass die Behandlung von E. coli mit Kasugamycin die Translation vollständig hemmt. Interessanterweise haben wir im Laufe der oben genannten Studien beobachtet, dass nach längerer Inkubation mit dem Antibiotikum die Synthese von einigen Proteinen wieder beginnt. Da in E. coli keine leaderless mRNAs bekannt sind und die Synthese der Proteine resistent gegen Kasugamycin ist, war das zweite Ziel meiner Arbeit, dieses Phänomen näher zu untersuchen. Nach der Identifizierung der Proteine mittels 2D-Gel-Analyse und Massenspektrometrie wurden die 5´-Enden der korrespondierenden mRNAs bestimmt. Die Studien haben gezeigt, dass diese mRNAs in Gegenwart von Kasugamycin durch einen alternativen Transkriptionsstart nahe am AUG Startcodon oder durch RNA-Degradierung „leaderless“ geworden sind. Weiters deuten die Ergebnisse darauf hin, dass eine RNA Interferase, MazF, an diesem Prozess beteiligt ist. Zusammengefaßt, weisen die Resultate meiner Arbeit auf eine noch nicht beschriebene Überlebensstrategie von Bakterien hin, die induziert wird, wenn die Translation gehemmt wird. Unter diesen Bedingungen könnte es zur Bildung von „leaderless“ mRNAs kommen, die selektiv von protein-defizienten Ribosomen translatiert werden können. Die Synthese dieser spezifischen Proteine könnte zum Überleben der Bakterien unter ungünstigen Bedingungen beitragen.

Abstract

(Englisch)

The aminoglycoside antibiotic kasugamycin inhibits translational initiation on canonical mRNAs, as it binds to the mRNA path in the ribosomal P-site and thus blocks the positioning of the mRNA and the initiator tRNA during translation initiation complex formation. In contrast, the antibiotic does not inhibit translation initiation on leaderless mRNAs, which contain a 5´-terminal start codon and therefore are devoid of ribosome recruitment signals present in the 5´-UTR. Recently, it has been shown that treatment of E. coli with kasugamycin results in the formation of ribosomes, which are deficient for several proteins from the 30S subunit. These particles -termed 61S particles, according to their sedimentation rate- lack the small ribosomal subunit proteins S1 and S2, which are essential for the translational of canonical mRNAs, and protein S12. As S12 has been shown to negatively influence the translational fidelity, and kasugamycin, unlike other aminoglycosides, does not induce frame shifting, misreading or read through, these data suggested that 61S particles might exhibit a higher translational fidelity. Therefore, the first aim of the study was to test for this assumption. Employing a leaderless GFP-construct, in vivo studies revealed an increased translational accuracy of the 61S particles, which might be attributed to the lack of the ribosomal protein S12. The addition of kasugamycin blocks the translation of bulk mRNA, as indicated by pulse labeling experiments. However, prolonged kasugamycin treatment results in restored translation of specific proteins. Therefore, the second aim of the study was the identification of the respective proteins by 2D gel analysis and subsequent mass spectrometry. Primer extension analysis of the corresponding mRNAs revealed that they were rendered leaderless upon kasugamycin treatment, either by alternative transcription or by a cleavage event closely upstream of the AUG start codon. Furthermore, the data suggested the possible implication of a known RNA interferase, MazF, which represents the toxin of a toxin-anti toxin module in E. coli. Overexpression of mazF resulted in the same cleavage in the leader region of the respective mRNAs, however, not in the coding region of these mRNAs. Taken together, these results may indicate a survival strategy for bacteria under conditions where translation is compromised, based on the formation of leaderless mRNAs, which are selectively translated by aberrant ribosomes deficient for some essential proteins. As the proteins synthesized in the presence of the antibiotic are primarily stress response proteins, the selective translation of this conditionally leaderless mRNA regulon might contribute to the viability of the cells under adverse conditions.

Autor*innen

Lena Sokol

Haupttitel (Englisch)

Selective and accurate translation by protein-depleted ribosomes formed in E. coli in the presence of kasugamycin in vivo

Paralleltitel (Deutsch)

In der Anwesenheit von Kasugamycin werden Protein-defiziente Ribosomen geformt, die seletkiv und genau translatieren können

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

60 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Udo Bläsi

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC08158797

Utheses ID

6358

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

Detailansicht

Abstracts

Schlagwörter