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Innovative tools for preclinical studies on anticancer drugs with metabolomics approaches
Mate Rusz
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (DissG: Chemie)
Betreuer*innen
Bernhard Keppler ,
Gunda Köllensperger
DOI
10.25365/thesis.72483
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-17029.14035.225965-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In dieser Dissertation wurden bioanalytische Ansätze und innovative Werkzeuge mit Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Metabolomik entwickelt und in präklinischen Studien zu Krebsmedikamenten angewendet. In der ersten Veröffentlichung wird die Optimierung der Probenvorbereitung für dreidimensionale multizelluläre Tumorsphäroide (3D MTS) Krebsmodelle vorgestellt. Ziel war es, eine geeignete Probenvorbereitungsmethode für Sphäroid-Zellkulturmodelle zu entwickeln, die mit LC-MS-basierter Metabolomik kompatibel ist. Eine besondere Herausforderung besteht darin, dass Sphäroide klein sind, einen Durchmesser von bis zu einem Millimeter haben und somit nicht nur mit bloßem Auge kaum sichtbar sind, sondern auch wesentlich weniger Biomaterial enthalten (nur einige 10.000 Zellen) als die herkömmlich verwendeten 2D-Monolayer-Zellkulturen. Der Arbeitsablauf wurde hinsichtlich des Extraktionsprotokolls, der Geschwindigkeit, der Waschschritte und der Mindestanzahl der benötigten Sphäroide optimiert. Das endgültige Protokoll ermöglicht einen beträchtlichen Durchsatz und Wiederholbarkeit (Reproduzierbarkeit), erfordert nur ein einziges Sub-mm-Sphäroid und kann leicht auf jede Zelllinie ausgeweitet werden, die dazu neigt, Sphäroide zu bilden. Schließlich wurde die Leistungsfähigkeit des Arbeitsablaufs in einem Proof-of-Principle-Experiment durch die Erstellung von Reaktionsprofilen von Sphäroiden demonstriert, die zwei verschiedenen krebsbekämpfenden Metallkomplexen, Oxaliplatin und BOLD-100/KP1339, ausgesetzt waren. Anschließend wurde eine kombinierte, vollständig parallelisierte Metabolomik- und Lebendzellbildgebungsmethode entwickelt, um die Vorteile der Anwendung von Bildgebungstechnologien wie der Lebendzellbildgebung zur Ergänzung der Metabolomik aufzuzeigen und zu veranschaulichen, dass eine solche Anwendung machbar ist. Darüber hinaus haben wir in einem Proof-of-Concept-Experiment ein Profil der frühen oxidativen Stressreaktion nach einer kurzen (2 h) Wasserstoffperoxid-Exposition erstellt und gezeigt, wie die Bildgebungs- und Omics-Methodik Mängel und blinde Flecken gegenseitig kompensieren. Wir haben die Stärke des Arbeitsablaufs demonstriert, indem wir komplexe und dynamische biologische Prozesse wie die Fragmentierung des mitochondrialen Netzwerks als Reaktion auf den zunehmenden externen Wasserstoffperoxid-Zufluss untersucht haben. Ein besonderes Merkmal ist, dass es in der Lage ist, zahllose Effekte im Zusammenhang mit der Reaktion auf oxidativen Stress in der Frühphase gleichzeitig in einem einzigen Experiment zu rekapitulieren. In der dritten Publikation untersuchten wir die metabolischen Grundlagen der erworbenen Resistenz in der HCT116-Zelllinie, wobei die erworbene Resistenz gegenüber dem etablierten Metalldroge Oxaliplatin und dem klinisch untersuchten BOLD-100/KP1339 untersucht wurde. Wir nutzten experimentell quantifizierte absolute Metabolitenkonzentrationen (normalisiert auf den Gesamtproteingehalt), um metabolische Flüsse mit genomspezifischer metabolischer Modellierung und Flux-Balance-Analyse rechnerisch zu bestimmen. Für die vollständige Modellierung wurden die intrazellulären Metabolitenmengen mit der Veränderung der extrazellulären Metabolitenmengen während eines Zeitverlaufsexperiments ergänzt und die Wachstumsrate für alle Modelle ermittelt. Was die Unterschiede zwischen den beiden Resistenzmodellen betrifft, so wurden die meisten Unterschiede bei den Stoffwechselflüsse im Fettsäure-, Aminosäure- und Nukleotidstoffwechsel festgestellt. Während die meisten dieser Stoffwechselwege in der Ru-basierten Resistenz aktiver sind, was darauf hindeutet, dass diese Zelllinie metabolisch aktiver ist, weisen Stoffwechselwege wie die Glykolyse und der Pentosephosphat-Stoffwechselweg in dem Pt-basierten Resistenzmodell höhere Flüsse auf. Wir haben zum ersten Mal eine Stoffwechselmodellierung auf Genomebene und eine Flux-Balance-Analyse angewandt, um die erworbene Metallodrug-Resistenz für zwei zelluläre Modelle zu untersuchen, und wir haben mehrere Stoffwechseleffekte identifiziert, die bei Metallodrug-Resistenz üblich sind, sowie weitere, die spezifisch für die Art des Medikaments sind.
Abstract
(Englisch)
In this Ph.D. thesis, bioanalytical approaches and innovative tools with liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics were developed and applied in preclinical studies on anticancer drugs. Within the first publication, the optimization of sample preparation for three-dimensional multicellular tumor spheroid (3D MTS) cancer models is presented. The aim was to develop a suitable sample preparation method for spheroid cell culture models which is compatible with LC-MS-based metabolomics. As a particular challenge, spheroids are small, grow up to one mm in diameter in a non-scaffold, suspension-based setting, thus they are not only barely visible to the naked eye but also contain substantially less biomaterial (only a few 10.000s of cells), than conventionally used 2D monolayer cell cultures. The workflow has been optimized in terms of the extraction protocol, speed, washing steps, and a minimum number of spheroids required. The final protocol enables considerable throughput and repeatability (reproducibility), it requires only a single sub-mm spheroid and can be easily extended to any cell line which is inclined to form spheroids. Finally, the capability of the workflow has been demonstrated in a proof-of-principle experiment by response-profiling of spheroids exposed to two different anticancer metal complexes, oxaliplatin and BOLD-100/KP1339. Next, a combined, fully parallelized metabolomics and live cell imaging methodology was developed to show the benefits of applying imaging technologies like live cell imaging to supplement metabolomics and illustrate that such an application is feasible. Furthermore, in a proof-of-concept experiment, we applied it to profile the early oxidative stress response upon a short (2 h) exposure to hydrogen peroxide and show how the imaging and omics methodology mutually compensate shortcomings and blind spots. We demonstrated the strength of the workflow by studying multifaceted and dynamic biological processes such as the fragmentation of the mitochondrial network in response to increasing external hydrogen peroxide influx. As a particular feature, it is able to recapitulate countless effects related to early phase oxidative stress response simultaneously in a single experiment. In the third publication we investigated the metabolic basis of acquired resistance in the HCT116 cell line, as acquired resistance towards the established metallodrug oxaliplatin and clinically investigated BOLD-100/KP1339 were examined. We used experimentally quantified absolute metabolite concentrations (normalized to total protein content) to determine metabolic fluxes with genome-scale metabolic modeling and flux-balance analysis computationally. For the complete modeling endeavor, the intracellular metabolite amounts were complemented with the change of extracellular metabolite levels during a time-course experiment and the growth rate had been obtained for all models. Regarding the difference between the two resistance models, most of the differences in metabolic fluxes were found in the fatty acid, amino acid and nucleotide metabolism. While most of these pathways are more active in the Ru-based resistance, indicating that this cell line is metabolically more active, pathways such as glycolysis and pentose phosphate pathway have higher fluxes in the Pt-based resistance model. We applied genome-scale metabolic modeling and flux-balance analysis for the first time to investigate acquired metallodrug resistance for two cellular models and identified multiple metabolic effects common in metallodrug resistance, as well as other ones specific to the type of drug.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Massenspektrometrie Flüssigchromatographie Krebs Resistenz Stoffwechsel Probenvorbereitung Bildgebungstechnologie metabolische Modellierung
Schlagwörter
(Englisch)
mass spectrometry liquid chromatography cancer resistance metabolism sample preparation imaging metabolic modeling
Autor*innen
Mate Rusz
Haupttitel (Englisch)
Innovative tools for preclinical studies on anticancer drugs with metabolomics approaches
Paralleltitel (Deutsch)
Innovative Ansätze für präklinische Studien über Krebsmedikamente mit Metabolomik
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
VII, 91 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Markus Mitterhauser ,
Barbara Bojko
AC Nummer
AC16661893
Utheses ID
63941
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |